살충제는 전 세계적인 식량 부족 문제 해결과 매개체 전염병 퇴치에 중요한 역할을 합니다. 그러나 살충제 내성 문제가 심화됨에 따라 활용도가 낮은 표적을 대상으로 하는 새로운 화합물 개발이 시급합니다. 곤충의 일시적 수용체 전위(TRPV) 채널인 난중(Nan)과 비활성(Iav)은 이종 채널(Nan-Iav)을 형성하여 곤충의 굴지성, 청각, 고유수용감각을 매개하는 기계감각 기관에 국소화될 수 있습니다. 아피도피롤리돈(AP)과 같은 일부 살충제는 알려지지 않은 기전을 통해 Nan-Iav를 표적으로 합니다. AP는 흡즙성 곤충(노린재목)에 효과적이며, 흡즙 섬유의 기능을 방해하여 섭식을 막습니다. AP는 Nan에만 결합할 수 있지만, Nan-Iav만이 내인성 니코틴아미드(NAM)를 포함한 작용제와 상호작용하여 채널 활성을 나타낼 수 있습니다. Nan-Iav는 살충제 표적으로서 잠재력이 크지만, 채널 조립, 조절 결합 부위 및 Ca2+ 의존적 조절에 대해서는 알려진 바가 거의 없어 살충제 개발에 어려움을 겪고 있습니다. 본 연구에서는 극저온 전자 현미경을 이용하여 노린재목 곤충에서 칼모듈린 리간드가 없는 상태와 안키린 반복 세포질 도메인(ARD) 경계에 AP 및 NAM이 결합된 상태의 Nan-Iav 구조를 규명했습니다. 놀랍게도, Nan 단백질 자체가 5량체를 형성할 수 있으며, 이는 AP 매개 ARD 상호작용에 의해 안정화된다는 사실을 발견했습니다. 본 연구는 살충제 및 작용제와 Nan-Iav 사이의 분자적 상호작용을 밝히고, 채널 기능 및 조립에서 ARD의 중요성을 강조하며, Ca2+ 조절 메커니즘을 탐구합니다.
점점 심각해지는 지구 기후 변화를 배경으로, 악화되는 세계 식량 안보는 21세기의 주요 과제 중 하나이며, 이는 사회 전반에 걸쳐 연쇄적인 영향을 미치고 있습니다.1,2세계보건기구(WHO)의 '2023년 세계 식량 안보 및 영양 현황(SOFI)' 보고서에 따르면 전 세계적으로 약 23억 3천만 명이 중등도에서 심각한 수준의 식량 불안정에 시달리고 있으며, 이는 오랫동안 지속되어 온 문제입니다.3,4불행히도 매년 작물 수확량의 20~30% 이상이 해충과 병원균으로 인해 손실되고 있으며, 지구 온난화는 해충의 저항력과 작물의 취약성을 더욱 악화시킬 것으로 예상됩니다.4,5,6,7,8살충제 개발은 작물을 해충으로부터 보호하고 매개체 전염병의 확산을 줄이는 데 중요할 뿐만 아니라, 살충제에 대한 내성이 점점 강해지고 있는 뎅기열, 말라리아, 샤가스병과 같은 매개체 전염병을 퇴치하는 데에도 매우 중요합니다.5, 9, 10, 11
신경독성 살충제의 주요 표적 중 하나인 이종사량체 TRPV 채널인 난충(Nan)-비활성(Iav) 채널은 이미다클로프리드와 피라클로스트로빈과 같은 시판 살충제를 포함하여 지난 10년 동안에야 발견된 살충제 표적 계열을 대표합니다.12, 13, 14반합성 살충제인 아피도피롤리펜(AP)은 최근 개발 및 상용화된 제품으로, 주성분은 활성 살충제인 인스칼리스®이며, 인스칼리스®는 나노몰 미만의 활성 수준에서 AP와 결합합니다.15AP는 수분 매개 곤충, 유익한 곤충 및 기타 비표적 생물에 대한 급성 독성이 낮으며, 라벨에 표시된 사용 지침에 따라 사용하면 다른 살충제에 대한 저항성 발생 가능성을 줄일 수 있습니다.16, 17, 18Nan과 Iav는 곤충 종 전체에 널리 분포하며, 더듬이와 사지의 현수체 수용체 뉴런에서만 함께 발현되고, 청각, 중력 인지 및 고유수용감각에 매우 중요합니다.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, 이미다클로프리드 및 피라클로스트로빈은 독특한 메커니즘을 통해 Nan-Iav 복합체를 자극하여 궁극적으로 고유수용감각 신호 전달을 억제합니다.13, 16, 23진딧물이나 흰파리와 같은 흡즙성 곤충(노린재목)의 경우, 고유수용감각 상실은 먹이 섭취 능력을 저하시켜 궁극적으로 죽음에 이르게 합니다.13,24흥미롭게도 AP는 Nan-Iav 복합체에 대해서는 높은 친화성을 보이지만 Nan 단독에 대해서는 낮은 친화성을 나타냅니다. AP가 Nan-Iav에 결합하면 전류가 유도되지만, Nan 단독에 결합하는 경우에는 채널 활성이 자극되지 않습니다. Iav 자체는 AP에 전혀 결합하지 않습니다.16이는 Nan과 Iav가 결합하여 서로 다른 Nan-Iav 채널 복합체(예: 서로 다른 화학양론적 비율 또는 동일한 화학양론적 비율 내에서 서로 다른 배열)를 형성하거나 AP가 여러 부위에 결합할 수 있음을 시사합니다. 더욱이, 천연 작용제인 니코틴아미드(NAM)는 초파리 Nan-Iav에 마이크로몰 농도 친화도로 결합하여 시험관 내에서 진딧물(AP)과 유사한 효과를 나타냅니다.16,25진딧물의 번식과 섭식을 억제하여 궁극적으로 죽음에 이르게 합니다.25,26이러한 데이터는 여러 가지 의문을 제기합니다. 예를 들어, Nan-Iav 이종이량체가 어떻게 형성되는지, 어떤 결합 부위가 소분자 조절에 사용되는지, 그리고 이러한 소분자들이 어떻게 고유수용감각을 억제함으로써 채널 기능을 조절하는지는 여전히 불분명합니다. 또한, Nan 자체는 비활성이고 활동전위에 대한 친화도가 낮은 반면, Nan-Iav 이종이량체는 활성이고 활동전위에 대한 친화도가 더 높은 이유도 명확하지 않습니다. 마지막으로, Nan-Iav 기능의 Ca2+ 의존적 조절과 이것이 신경 신호 전달 과정에 어떻게 통합되는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.. 13,21
본 연구에서는 극저온 전자 현미경, 전기생리학 및 방사성 리간드 결합 기술을 결합하여 Nan-Iav의 조립 과정과 소분자 조절인자와의 결합 메커니즘을 규명했습니다. 또한, Iav와 AP로 안정화된 Nan 펜타머에 칼모듈린(CaM)이 항상 결합되어 있음을 확인했습니다. 이러한 결과는 채널 내 칼슘 이온 조절, 채널 조립 및 리간드 결합 친화도를 결정하는 요인에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 더욱 중요한 것은, ARD가 이러한 과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 확인했다는 점입니다. 본 연구는 관련 농약과 결합된 완전한 곤충 채널에 대한 연구입니다.27, 28, 29이는 살충제 산업 발전에 대한 전망을 열어주고, 살충제의 효능과 특이성을 향상시키며, TRPV 표적 화합물을 다른 종에도 적용하여 세계 식량 안보와 매개체 전염병 확산 문제를 해결할 수 있도록 합니다.
또한, Nan-Iav가 Ca2+에 의해 조절되며, 그 조절 기전은 항상 결합되어 있는 CaM에 의해 매개된다는 것을 발견했습니다. 중요한 것은, CaM에 의한 Nav의 이러한 Ca2+ 의존적 조절 방식이 다른 이온 채널(예: 전압 개폐형 Na+ 채널 및 TRPV5/6 채널)의 조절 기전과는 상당히 다르다는 점입니다.52, 53, 54, 55, 56, 57Nav1.2 채널에서 CaM의 C-말단 도메인은 C-말단 도메인(CTD)과 나선형으로 결합하며, Ca2+는 CaM의 N-말단 도메인이 CTD의 말단 부분에 결합하도록 유도합니다.56TRPV5/6 채널에서 CaM의 C-말단 도메인은 CTH에 결합하고, Ca2+는 CaM의 N-말단 도메인이 채널 내로 위쪽으로 확장되도록 유도하여 양이온 투과성을 차단합니다.53,54본 연구에서는 Nan-Iav-CaM의 Ca2+ 조절 기능에 대한 모델을 제시합니다(그림 4h). 이 모델에서 CaM의 N-말단 도메인은 Iav의 C-말단 도메인(CTH)에 항상 결합되어 있습니다. 휴지 상태(낮은 [Ca2+] 농도)에서 CaM의 C-말단 도메인은 Nan과 상호작용하여 ARD 구조를 안정화시키고 채널 개방을 촉진합니다. 작용제/살충제가 채널에 결합하면 기공이 열려 Ca2+가 유입됩니다. Ca2+는 CaM에 결합하여 Nan의 ARD로부터 C-말단 도메인을 분리시킵니다. CaM 결합을 차단하면 Ca2+의 억제 효과가 사실상 사라지기 때문에, 이러한 분리는 ARD 이동성을 조절하여 Ca2+ 의존적 억제 또는 탈감작을 유발합니다. 칼슘 이온 용출 후 채널 전류의 빠른 회복(그림 4g)은 이 메커니즘이 Ca2+ 매개 신경 신호에 대한 빠른 반응을 촉진한다는 것을 시사합니다. 또한, 아직 제대로 이해되지 않은 Iav의 C-말단 영역은 채널 표적화 및 전류 조절에서 다른 역할을 하는 것으로 보고되었습니다.21
마지막으로, 본 연구는 농업적으로 중요한 살충제-살충제 TRP 채널 복합체의 고해상도 구조를 제시합니다. 이는 이전에는 알려지지 않았던 발견입니다. 특히, 우리는 곤충 세포가 아닌 인간 세포(HEK293S GnTi–)에서 곤충 채널의 구조와 기능을 규명했습니다. 살충제 내성이 증가하고 식량 안보 및 병원균에 대한 압력이 지속되는 상황에서, 본 연구는 인류 건강과 세계 식량 안보에 도움이 될 새로운 살충제 개발을 촉진하는 중요한 정보를 제공합니다. 여러 연구에서 AP와 같은 살충제가 사용 설명서에 따라 사용될 경우 일부 해충에 효과적이며, 유익한 수분 매개체에 대한 급성 독성이 낮아 환경적으로 안전하다는 것이 입증되었습니다.13,16또한, 일부 AP 유도체를 모기에 적용하여 시험한 결과, 결국 비행 능력을 상실하는 것으로 나타났습니다. 이러한 조절 화합물이 Nan-Iav에 어떻게 결합하는지 이해하면 기존 화합물을 수정하거나 보다 효과적인 새로운 화합물을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.정밀한해충 방제. 본 연구는 Nan-Iav ARD 인터페이스가 내인성 화합물, 살충제 및 Ca2+-CaM의 활성 조절뿐만 아니라 채널 조립에도 매우 중요하다는 것을 보여줍니다. 우리는 소분자를 이용하여 이종이량체 조립을 방해하는 것이 이온 채널 억제제 개발을 위한 독창적이고 유망한 접근 방식이 될 수 있다고 제안합니다.
8개의 상동 유전자 중, 세제에 대한 안정성이 우수한 갈색 딱정벌레(Halyomorpha halys) Nanchung 및 Inactive의 전체 길이 유전자를 선택했습니다. 합성된 유전자는 인간 발현에 최적화되도록 코돈 최적화되었고, XhoI 및 EcoRI 제한 효소 부위를 이용하여 pBacMam pCMV-DEST 벡터(Life Technologies)에 클로닝되었습니다. 이를 통해 클론이 C-말단 GFP-FLAG-10xHis 및 mCherry-FLAG-10xHis 태그와 정확한 프레임을 갖도록 보장했으며, 이 태그는 HRC-3C 프로테아제(PPX)에 의해 절단되어 독립적인 발현이 가능하게 합니다.표현Nanchung과 Inactive를 pBacMam 벡터에 클로닝하는 데 사용된 프라이머는 다음과 같습니다.
개별 입자의 미세 이미지는 K3 카메라와 Gatan BioQuantum 에너지 필터가 장착된 Titan Krios G2 투과 전자 현미경(FEI)을 사용하여 얻었습니다. 현미경은 300 keV의 에너지 설정, 20 eV의 에너지, 1.08 Å/픽셀의 시료 픽셀 크기(공칭 배율 81,000배), 그리고 -0.8~-2.2 μm 범위의 초점 이탈 기울기 조건으로 작동되었습니다. 비디오 녹화는 Latitude S 현미경(Gatan)을 사용하여 초당 40프레임으로 수행되었으며, 공칭 선량률은 25 e–px−1 s−1, 노출 시간은 2.4초, 총 선량은 약 60 e–Å−2였습니다.
RELION 4.061의 MotionCor2를 사용하여 필름에서 빔 유도 움직임 보정 및 선량 가중치를 수행했습니다. 대비 전달 함수(CTF) 매개변수 추정은 패치 기반 CTF 추정 방법62을 사용하여 cryoSPARC에서 수행했습니다. CTF 피팅 해상도가 4Å 이상인 현미경 사진은 후속 분석에서 제외했습니다. 일반적으로 cryoSPARC에서 점 선택을 위해 500~1000개의 현미경 사진 하위 집합을 사용한 후, 필터링을 거쳐 템플릿 기반 입자 선택을 위한 명확한 참조 이미지를 얻기 위해 여러 차례 2D 분류를 수행했습니다. 그런 다음 64픽셀 경계 상자와 4배 비닝을 사용하여 입자를 추출했습니다. 원치 않는 입자 범주를 제거하기 위해 여러 차례 2D 분류를 수행했습니다. 초기 3D 모델은 ab initio 재구성을 사용하여 재구성하고 cryoSPARC에서 비균일 정제를 사용하여 정제했습니다. 3D 분류는 ARD 이질성을 기반으로 cryoSPARC 또는 RELION에서 수행했습니다. 막 영역의 유의미한 이질성은 관찰되지 않았습니다. 입자는 C1 및 C2 방법을 사용하여 정제되었으며, C2 해상도가 높은 입자는 C2에 대해 대칭적인 것으로 간주하여 베이지안 정제를 위해 RELION으로 가져왔습니다. 그런 다음 입자를 다시 cryoSPARC로 전송하여 최종 비균일 및 국소 정제를 수행했습니다. 최종 해상도와 입자 수는 표 1에 나와 있습니다.
Nan+AP 펜타머를 처리할 때, 신호 감산 및 TMD 마스킹과 같은 다양한 방법을 사용하여 막 도메인(특히 기공 영역)의 해상도를 향상시키려고 시도했습니다. 그러나 기공 영역의 극심한 무질서와 TMD의 전반적인 이질성 때문에 이러한 시도는 성공적이지 못했습니다. 최종 해상도는 cryoSPARC의 비균일 처리 방법을 통해 자동으로 생성된 마스크를 사용하여 계산되었으며, 주로 ARD 영역을 대상으로 했습니다. 이를 통해 막 도메인(특히 VSLD 영역)보다 훨씬 높은 해상도를 얻을 수 있었습니다.
Coot63을 사용하여 Nanchung 및 Inactive 벌레의 아포 형태에 대한 초기 de novo 모델을 먼저 생성했으며, 신뢰도가 낮은 영역을 식별하기 위해 AlphaFold264를 사용하여 Nan 및 Iav 벌레의 모델을 생성했습니다. 칼모듈린 모델링은 PDB 접근 번호 4JPZ56 및 1CFD65에 있는 Ca2+ 결합 및 Ca2+ 비결합 모델의 강체 맞춤을 기반으로 했습니다. 모델은 정확한 입체화학적 구조와 양호한 기하학적 구조를 확보하기 위해 구형 정밀화법을 사용하여 정밀화했습니다. 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린은 잘 정의된 지질 밀도로 모델링되었고, NAM 및 AP 리간드는 밀착 연접 부위의 해당 밀도에 배치되었습니다. 제약 조건 파일은 PHENIX66의 eLBOW를 사용하여 이소형의 SMILES 문자열로부터 생성되었습니다. 마지막으로, PHENIX에서 로컬 그리드 검색과 2차 구조 제약 조건을 사용한 전역 최소화를 통해 실제 공간에서 모델을 정밀화했습니다. MolProbity 서버는 모델 정밀화 및 구조 분석에 사용되었고, 그림은 PyMOL과 UCSF Chimera X를 사용하여 작성되었습니다. 67,68,69 개구 분석은 HOLE 서버를 사용하여 수행되었고, 70 서열 보존 매핑은 Consurf 서버를 사용하여 수행되었습니다. 71
통계 분석은 Igor Pro 6.2, Excel Office 365 및 GraphPad Prism 7.0을 사용하여 수행되었습니다. 모든 정량적 데이터는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 제시되었습니다. 두 그룹 간 비교에는 Student t-검정(양측 검정, 비쌍)을 사용했습니다. 여러 그룹 간 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA) 후 Dunnett 사후 검정을 사용했습니다. *P< 0.05, **P< 0.01, 그리고 ***P데이터 분포에 따라 p < 0.001인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주했습니다. Kd, Ki 값 및 비대칭 95% 신뢰 구간은 GraphPad Prism 10을 사용하여 계산했습니다.
연구 방법론에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 네이처 포트폴리오 보고서 요약을 참조하십시오.
초기 모델은 PDB 4JPZ 및 1CFD 데이터베이스의 칼모듈린 모델을 사용하여 구축되었습니다. 해당 좌표는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 9NVN(리간드가 없는 Nan-Iav-CaM), 9NVO(니코틴아미드가 결합된 Nan-Iav-CaM), 9NVP(니코틴아미드와 EDTA가 결합된 Nan-Iav-CaM), 9NVQ(아페니돌피롤린과 칼슘이 결합된 Nan-Iav-CaM), 9NVR(아페니돌피롤린과 EDTA가 결합된 Nan-Iav-CaM), 9NVS(아페니돌피롤린이 결합된 Nan 펜타머)의 접근 번호로 등록되었습니다. 해당 극저온 전자 현미경 이미지는 다음 접근 번호로 전자 현미경 데이터베이스(EMDB)에 등록되었습니다. EMD-49844(리간드가 없는 Nan-Iav-CaM), EMD-49845(니코틴아미드와 결합한 Nan-Iav-CaM 복합체), EMD-49846(니코틴아미드와 EDTA와 결합한 Nan-Iav-CaM 복합체), EMD-49847(아피도피롤린과 칼슘과 결합한 Nan-Iav-CaM 복합체), EMD-49848(아피도피롤린과 EDTA와 결합한 Nan-Iav-CaM 복합체), 그리고 EMD-49849(아피도피롤린과 결합한 Nan 펜타머 복합체). 기능 분석을 위한 원 데이터는 본 논문에 제시되어 있습니다.
게시 시간: 2026년 1월 28일