구충제 N,N-디에틸-m-톨루아미드(디트디에틸에틸에틸아민(DEET)은 아세틸콜린에스테라제(AChE)를 억제하고 과도한 혈관 생성을 유발하여 발암 가능성이 있는 것으로 알려져 있습니다. 본 연구에서는 DEET가 혈관 신생을 촉진하는 내피세포를 특이적으로 자극하여 종양 성장을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. DEET는 증식, 이동, 접착을 포함한 혈관 신생으로 이어지는 세포 과정을 활성화합니다. 이는 내피세포에서 NO 생성 증가 및 VEGF 발현 증가와 관련이 있습니다. M3 유전자를 억제하거나 약리학적 M3 억제제를 사용하면 이러한 효과가 모두 사라지는 것으로 보아 DEET 유도 혈관 신생은 M3 수용체에 민감함을 알 수 있습니다. 내피세포와 M3 수용체를 과발현하는 HEK 세포에서 칼슘 신호 전달에 관한 실험 및 결합 및 도킹 연구를 통해 DEET가 M3 수용체의 알로스테릭 조절인자로 작용함을 확인했습니다. 또한, DEET는 AChE를 억제하여 아세틸콜린의 생체 이용률과 M3 수용체와의 결합을 증가시키고, 알로스테릭 조절을 통해 혈관 신생 촉진 효과를 강화합니다.
스위스 마우스의 대동맥에서 일차 EC를 분리했습니다. 추출 방법은 Kobayashi 프로토콜 26을 변형하여 사용했습니다. 마우스 EC는 5% 열처리 불활성화 FBS가 첨가된 EBM-2 배지에서 4대까지 배양했습니다.
두 가지 농도의 DEET가 HUVEC, U87MG 또는 BF16F10 세포의 증식에 미치는 영향을 CyQUANT 세포 증식 분석 키트(Molecular Probes, C7026)를 사용하여 분석했습니다. 간단히 설명하면, 96웰 플레이트에 웰당 5 × 10³개의 세포를 접종하고 하룻밤 동안 부착시킨 후, 24시간 동안 DEET로 처리했습니다. 배양 배지를 제거한 후, 각 웰에 염색 결합 용액을 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 형광 강도는 485nm 여기 필터와 530nm 방출 필터가 장착된 Mithras LB940 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 측정했습니다.
HUVEC 세포를 96웰 플레이트에 웰당 10⁴개씩 접종하였다. 세포에 DEET를 24시간 처리한 후, 비색 MTT 분석법(Sigma-Aldrich, M5655)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 흡광도는 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Mithras LB940)를 사용하여 570nm 파장에서 측정하였다.
DEET의 효과는 시험관 내 혈관신생 분석을 통해 연구되었습니다. 10⁻⁸ M 또는 10⁻⁵ M 농도의 DEET 처리 시 HUVEC에서 모세혈관 길이가 증가했습니다(그림 1a, b, 흰색 막대). 대조군과 비교했을 때, 10⁻¹⁴ M에서 10⁻⁵ M 범위의 DEET 농도 처리에서 모세혈관 길이는 10⁻⁸ M 농도에서 최대치에 도달했습니다(보충 그림 S2). 10⁻⁸ M과 10⁻⁵ M 농도 범위의 DEET로 처리한 HUVEC의 시험관 내 혈관신생 촉진 효과에는 유의미한 차이가 없었습니다.
DEET가 신생혈관 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 생체 내 신생혈관 형성 연구를 수행했습니다. 14일 후, 10⁻⁸ M 또는 10⁻⁵ M DEET로 전배양한 내피세포를 주입한 쥐에서 헤모글로빈 함량이 유의하게 증가했습니다(그림 1c, 흰색 막대).
또한, DEET 유도 신생혈관 형성은 U87MG 이종이식 종양을 가진 마우스에 DEET를 매일 복강 주사(ip)하여 연구했습니다. DEET 용량은 인체 노출 시 정상적인 혈장 농도인 10⁻⁵ M을 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 23 U87MG 세포를 마우스에 주입한 후 14일 만에 검출 가능한 종양(즉, 100 mm³ 이상의 종양)이 관찰되었습니다. 28일째에 DEET를 투여한 마우스에서 대조군 마우스에 비해 종양 성장이 유의하게 증가했습니다(그림 1d, 사각형). 또한, 종양의 CD31 염색 결과 DEET는 모세혈관 면적은 유의하게 증가시켰지만 미세혈관 밀도는 증가시키지 않았습니다(그림 1e–g).
DETA 유도 증식에서 무스카린 수용체의 역할을 규명하기 위해, 선택적 M3 수용체 길항제인 pFHHSiD(10⁻⁷ M) 존재 하에 10⁻⁸ M 또는 10⁻⁵ M의 DETA를 사용했습니다. HUVEC에 대한 처리 결과, pFHHSiD는 모든 농도에서 DETA의 증식 특성을 완전히 억제했습니다(표 1).
이러한 조건에서 우리는 DEET가 HUVEC 세포의 모세혈관 길이를 증가시키는지 여부도 조사했습니다. 마찬가지로, pFHHSiD는 DEET에 의해 유도된 모세혈관 길이 증가를 유의하게 억제했습니다(그림 1a, b, 회색 막대). 또한, M3 siRNA를 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 대조군 siRNA는 모세혈관 형성을 촉진하는 데 효과가 없었지만, M3 무스카린 수용체의 발현을 억제하면 DEET에 의한 모세혈관 길이 증가 효과가 사라졌습니다(그림 1a, b, 검은색 막대).
또한, 10⁻⁸ M 또는 10⁻⁵ M DEET에 의해 유도된 시험관 내 혈관형성과 생체 내 신생혈관형성은 모두 pFHHSiD에 의해 완전히 차단되었다(그림 1c, d, 원). 이러한 결과는 DEET가 선택적 M3 수용체 길항제 또는 M3 siRNA에 민감한 경로를 통해 혈관신생을 촉진한다는 것을 나타낸다.
AChE는 DEET의 분자 표적입니다. 도네페질과 같은 AChE 억제제는 시험관 내 및 마우스 뒷다리 허혈 모델에서 내피세포 신생혈관 생성을 자극할 수 있습니다.14 우리는 HUVEC에서 두 가지 농도의 DEET가 AChE 효소 활성에 미치는 영향을 테스트했습니다. 낮은 농도(10⁻⁸ M)와 높은 농도(10⁻⁵ M)의 DEET는 대조군 조건에 비해 내피세포의 AChE 활성을 감소시켰습니다(그림 2).
DEET의 두 농도(10⁻⁸ M 및 10⁻⁵ M) 모두 HUVEC에서 아세틸콜린에스테라제 활성을 감소시켰습니다. BW284c51(10⁻⁵ M)을 아세틸콜린에스테라제 억제제의 대조군으로 사용했습니다. 결과는 DEET를 두 농도로 처리한 HUVEC에서 아세틸콜린에스테라제 활성을 대조군(vehicle-treated cells)에 비해 백분율로 나타냈습니다. 값은 6회 독립 실험의 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시했습니다. *p < 0.05 (Kruskal-Wallis 검정 및 Dunn 다중 비교 검정).
산화질소(NO)는 혈관신생 과정에 관여하므로, DEET로 자극된 HUVEC에서 NO 생성을 연구했습니다. DEET 처리된 내피세포의 NO 생성은 대조군 세포에 비해 증가했지만, 10⁻⁸ M 농도에서만 유의미한 차이를 보였습니다(그림 3c). DEET 유도 NO 생성을 조절하는 분자적 변화를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 통해 eNOS 발현 및 활성화를 분석했습니다. DEET 처리는 eNOS 발현에는 변화를 주지 않았지만, eNOS 인산화는 미처리 세포에 비해 활성화 부위(Ser-1177)에서 유의하게 증가시키고 억제 부위(Thr-495)에서는 감소시켰습니다(그림 3d). 또한, 인산화된 eNOS의 양을 전체 효소량으로 정규화한 후 활성화 부위와 억제 부위의 인산화 비율을 계산했습니다. 이 비율은 모든 농도의 DEET로 처리된 HUVEC에서 미처리 세포에 비해 유의하게 증가했습니다(그림 3d).
마지막으로, 주요 혈관신생 촉진 인자 중 하나인 VEGF의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. DEET는 VEGF 발현을 유의하게 증가시킨 반면, pFHHSiD는 이 발현을 완전히 억제하였다.
DEET의 효과는 약리학적 차단과 M3 수용체의 하향 조절 모두에 민감하기 때문에, DEET가 칼슘 신호 전달을 강화할 수 있다는 가설을 검증했습니다. 놀랍게도, 사용된 두 농도 모두에서 DEET는 HUVEC(데이터 미제시)와 HEK/M3(그림 4a, b) 세포질 내 칼슘 농도를 증가시키지 못했습니다.
게시 시간: 2024년 12월 30일