구충제 N,N-디에틸-m-톨루아미드(디트)는 AChE(아세틸콜린에스테라아제)를 억제하는 것으로 보고되었으며, 과도한 혈관신생으로 인해 잠재적인 발암성을 가지고 있습니다. 본 논문에서는 DEET가 혈관신생을 촉진하는 내피세포를 특이적으로 자극하여 종양 성장을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. DEET는 증식, 이동, 부착을 포함한 혈관신생으로 이어지는 세포 과정을 활성화합니다. 이는 내피세포에서 NO 생성 및 VEGF 발현 증가와 관련이 있습니다. M3를 억제하거나 약리학적 M3 억제제를 사용하면 이러한 모든 효과가 사라졌으며, 이는 DEET 유도 혈관신생이 M3에 민감함을 시사합니다. M3 수용체를 과발현하는 내피세포 및 HEK 세포에서 칼슘 신호전달과 관련된 실험과 결합 및 도킹 연구는 DEET가 M3 수용체의 알로스테릭 조절제 역할을 함을 시사합니다. 또한, DEET는 AChE를 억제하여 아세틸콜린의 생체이용률과 M3 수용체와의 결합을 증가시키고, 알로스테릭 조절을 통해 혈관신생 촉진 효과를 향상시킵니다.
일차 내피세포(EC)는 스위스 마우스의 대동맥에서 분리하였다. 추출 방법은 고바야시 프로토콜(Kobayashi protocol)26을 참고하였다. 마우스 내피세포(EC)는 5% 열불활성화 FBS가 첨가된 EBM-2 배지에서 4차 계대 배양하였다.
두 가지 농도의 DEET가 HUVEC, U87MG 또는 BF16F10의 증식에 미치는 영향을 CyQUANT 세포 증식 분석 키트(Molecular Probes, C7026)를 사용하여 분석했습니다. 간략하게 설명하면, 웰당 5.103개의 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 부착시킨 후 DEET로 24시간 동안 처리했습니다. 배양 배지를 제거한 후, 마이크로플레이트의 각 웰에 염료 결합 용액을 첨가하고 세포를 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 형광 수준은 485 nm 여기 필터와 530 nm 방출 필터가 장착된 Mithras LB940 다중모드 마이크로플레이트 판독기(Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 측정했습니다.
HUVEC를 96웰 플레이트에 웰당 104개의 세포 밀도로 분주했습니다. 세포를 DEET로 24시간 동안 처리했습니다. 세포 생존율은 비색 MTT 분석법(Sigma-Aldrich, M5655)을 사용하여 평가했습니다. 광학 밀도 값은 다중모드 마이크로플레이트 리더(Mithras LB940)를 사용하여 570nm 파장에서 측정했습니다.
DEET의 효과는 시험관 내 혈관신생 검정법을 사용하여 연구되었습니다. 10-8 M 또는 10-5 M DEET 처리는 HUVEC에서 모세혈관 길이 형성을 증가시켰습니다(그림 1a, b, 흰색 막대). 대조군과 비교하여, 10-14 M에서 10-5 M 범위의 DEET 농도로 처리한 경우, 모세혈관 길이가 10-8 M DEET에서 정체기에 도달했습니다(보충 그림 S2). 10-8 M 및 10-5 M 농도 범위에서 DEET로 처리한 HUVEC의 시험관 내 혈관신생 효과에는 유의미한 차이가 없었습니다.
DEET가 신생혈관형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 생체 내 신생혈관형성 연구를 수행했습니다. 14일 후, 10-8 M 또는 10-5 M DEET로 전배양된 내피세포를 주입한 생쥐에서 헤모글로빈 함량이 유의미하게 증가했습니다(그림 1c, 흰색 막대).
또한, DEET 유도 신생혈관형성은 U87MG 이종이식 마우스에게 DEET를 매일(복강 내) 주사하여 연구했습니다. 이 용량은 노출된 사람에게서 정상 수준인 10-5 M의 혈장 농도를 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 23일째, U87MG 세포를 마우스에 주사한 후 14일째에 검출 가능한 종양(즉, 100 mm³ 이상의 종양)이 관찰되었습니다. 28일째, DEET를 투여한 마우스에서 종양 성장이 대조군 마우스에 비해 유의하게 증가했습니다(그림 1d, 사각형). 또한, 종양의 CD31 염색 결과, DEET는 모세혈관 면적을 유의하게 증가시켰지만 미세혈관 밀도는 증가시키지 않았습니다(그림 1e–g).
DETA 유도 증식에서 무스카린 수용체의 역할을 확인하기 위해, pFHHSiD(10-7 M, 선택적 M3 수용체 길항제) 존재 하에 10-8 M 또는 10-5 M DETA를 사용하였다. HUVEC pFHHSiD 처리는 모든 농도에서 DETA의 증식 특성을 완전히 차단하였다(표 1).
이러한 조건에서 DEET가 HUVEC 세포에서 모세혈관 길이를 증가시키는지 여부도 조사했습니다. 마찬가지로, pFHHSiD는 DEET로 유도된 모세혈관 길이를 유의하게 억제했습니다(그림 1a, b, 회색 막대). 또한, M3 siRNA를 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 대조군 siRNA는 모세혈관 형성을 촉진하는 데 효과적이지 않았지만, M3 무스카린 수용체를 억제하자 DEET의 모세혈관 길이 증가 효과가 사라졌습니다(그림 1a, b, 검은색 막대).
더욱이, 10-8 M 또는 10-5 M DEET에 의해 유도된 시험관 내 혈관신생과 생체 내 신생혈관형성은 pFHHSiD에 의해 완전히 차단되었다(그림 1c, d, 원). 이러한 결과는 DEET가 선택적 M3 수용체 길항제 또는 M3 siRNA에 민감한 경로를 통해 혈관신생을 촉진함을 시사한다.
AChE는 DEET의 분자 표적입니다. AChE 억제제로 작용하는 도네페질과 같은 약물은 시험관 내 실험 및 마우스 뒷다리 허혈 모델에서 내피세포의 혈관신생을 자극할 수 있습니다. 본 연구에서는 두 가지 농도의 DEET가 HUVEC에서 AChE 효소 활성에 미치는 영향을 시험했습니다. 저농도(10-8 M)와 고농도(10-5 M)의 DEET는 대조군에 비해 내피세포의 AChE 활성을 감소시켰습니다(그림 2).
DEET 두 농도(10-8 M 및 10-5 M) 모두 HUVEC에서 아세틸콜린에스테라제 활성을 감소시켰습니다. BW284c51(10-5 M)은 아세틸콜린에스테라제 억제제의 대조군으로 사용되었습니다. 결과는 두 가지 농도의 DEET로 처리한 HUVEC에서 비히클을 처리한 세포와 비교하여 AChE 활성의 백분율로 표현되었습니다. 값은 6회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준오차(SEM)로 표현되었습니다. *대조군 대비 p < 0.05 (Kruskal-Wallis and Dunn multiple comparison test).
일산화질소(NO)는 혈관신생 과정에 관여하므로 33 DEET로 자극한 HUVEC에서 NO 생성을 연구했습니다. DEET로 처리한 내피세포의 NO 생성은 대조군 세포에 비해 증가했지만, 10-8 M 용량에서만 유의미한 수준에 도달했습니다(그림 3c). DEET로 유도된 NO 생성을 조절하는 분자적 변화를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 통해 eNOS 발현과 활성화를 분석했습니다. DEET 처리는 eNOS 발현에는 영향을 미치지 않았지만, 활성화 부위(Ser-1177)에서 eNOS 인산화를 유의미하게 증가시켰고, 억제 부위(Thr-495)에서는 무처리 세포에 비해 eNOS 인산화가 감소했습니다(그림 3d). 또한, 인산화된 eNOS의 양을 효소 총량으로 정규화한 후 활성화 부위와 억제 부위에서 인산화된 eNOS의 비율을 계산했습니다. 이 비율은 각 농도의 DEET로 처리한 HUVEC에서 무처리 세포에 비해 유의미하게 증가했습니다(그림 3d).
마지막으로, 주요 혈관신생 인자 중 하나인 VEGF의 발현을 Western blotting으로 분석하였다. DEET는 VEGF 발현을 유의미하게 증가시켰지만, pFHHSiD는 이 발현을 완전히 차단하였다.
DEET의 효과는 약리학적 차단과 M3 수용체의 하향조절 모두에 민감하므로, DEET가 칼슘 신호전달을 증진시킬 수 있다는 가설을 검증했습니다. 놀랍게도, DEET는 두 농도 모두에서 HUVEC(데이터 미제시)와 HEK/M3(그림 4a, b)에서 세포질 칼슘 농도를 증가시키지 못했습니다.
게시 시간: 2024년 12월 30일