본 연구에서는 복합 치료의 자극 효과를 살펴보았다.식물 생장 조절제2,4-D와 키네틴, 그리고 산화철 나노입자(Fe₃O₄-NPs)가 히페리쿰 페르포라툼(Hypericum perforatum L.)의 시험관 내 형태 형성 및 이차 대사산물 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 최적화된 처리 조건[2,4-D(0.5 mg/L) + 키네틴(2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs(4 mg/L)]은 식물 생장 지표를 유의하게 향상시켰다. 대조군과 비교했을 때, 식물 높이는 59.6%, 뿌리 길이는 114.0%, 꽃눈 수는 180.0%, 캘러스 생중량은 198.3% 증가하였다. 또한, 이 복합 처리는 재생 효율을 50.85% 향상시키고 히페리신 함량을 66.6% 증가시켰다. GC-MS 분석 결과, 하이페로사이드, β-파톨렌, 세틸알코올 함량이 높게 나타났으며, 이는 전체 피크 면적의 93.36%를 차지했습니다. 또한, 총 페놀류와 플라보노이드 함량은 최대 80.1% 증가했습니다. 이러한 결과는 식물 생장 조절제(PGR)와 Fe₃O₄ 나노입자(Fe₃O₄-NPs)가 기관 형성 및 생리활성 화합물 축적을 촉진하여 시너지 효과를 발휘함을 시사하며, 이는 약용 식물의 생명공학적 개량을 위한 유망한 전략이 될 수 있습니다.
세인트존스워트(Hypericum perforatum L.)는 Hypericaceae과에 속하는 여러해살이 초본 식물로 경제적 가치가 있습니다.[1] 세인트존스워트의 잠재적인 생리활성 성분에는 천연 탄닌, 크산톤, 플로로글루시놀, 나프탈렌디안트론(하이페린 및 슈도하이페린), 플라보노이드, 페놀산 및 에센셜 오일이 포함됩니다.[2,3,4] 세인트존스워트는 전통적인 방법으로 번식시킬 수 있지만, 전통적인 방법의 계절성, 낮은 종자 발아율 및 질병에 대한 취약성으로 인해 대규모 재배 및 이차 대사산물의 지속적인 생성 가능성이 제한됩니다.[1,5,6]
따라서 시험관 내 조직 배양은 식물의 신속한 증식, 유전자원 보존 및 약용 화합물의 수율 증대에 효과적인 방법으로 여겨진다[7, 8]. 식물 생장 조절제(PGR)는 형태 형성을 조절하는 데 중요한 역할을 하며 캘러스 및 전체 유기체의 시험관 내 배양에 필수적이다. 이러한 발달 과정을 성공적으로 완료하기 위해서는 PGR의 농도와 조합을 최적화하는 것이 중요하다[9]. 그러므로 세인트존스워트(H. perforatum)의 생장 및 재생 능력을 향상시키기 위해서는 조절제의 적절한 조성과 농도를 이해하는 것이 중요하다[10].
산화철 나노입자(Fe₃O₄)는 조직 배양을 위해 개발되었거나 개발 중인 나노입자의 한 종류입니다. Fe₃O₄는 상당한 자기적 특성, 우수한 생체 적합성, 식물 성장 촉진 및 환경 스트레스 감소 능력을 가지고 있어 조직 배양 설계에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 이러한 나노입자의 잠재적 응용 분야에는 세포 분열 촉진, 영양분 흡수 개선 및 항산화 효소 활성화를 위한 시험관 내 배양 최적화가 포함될 수 있습니다[11].
나노입자는 식물 생장 촉진에 탁월한 효과를 보여왔지만, Fe₃O₄ 나노입자와 최적화된 식물 생장 조절제를 *H. perforatum*에 병용 적용한 연구는 아직 미흡한 실정입니다. 이러한 연구 공백을 메우기 위해 본 연구에서는 Fe₃O₄ 나노입자와 최적화된 식물 생장 조절제의 병용 효과가 시험관 내 형태 형성 및 이차 대사산물 생산에 미치는 영향을 평가하여 약용 식물의 특성 개선에 대한 새로운 통찰력을 제공하고자 했습니다. 따라서 본 연구는 (1) 시험관 내에서 캘러스 형성, 줄기 재생 및 발근을 효과적으로 촉진하는 식물 생장 조절제의 최적 농도를 도출하고, (2) Fe₃O₄ 나노입자가 시험관 내 생장 매개변수에 미치는 영향을 평가하는 두 가지 목적을 설정했습니다. 향후 연구에서는 순화 과정(시험관 내) 동안 재생 식물의 생존율을 평가할 계획입니다. 본 연구 결과가 *H. perforatum*의 미세번식 효율을 크게 향상시켜 이 중요한 약용 식물의 지속 가능한 이용과 생명공학적 응용에 기여할 것으로 기대합니다.
본 연구에서는 야외에서 재배한 한해살이풀인 세인트존스워트(모체 식물)에서 잎 절편을 채취하여 시험관 내 배양 조건을 최적화하는 데 사용했습니다. 배양 전, 잎은 흐르는 증류수에 몇 분 동안 충분히 헹궈냈습니다. 그런 다음 절편 표면을 70% 에탄올에 30초간 담가 소독하고, 이어서 Tween 20 몇 방울을 첨가한 1.5% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 10분간 담갔습니다. 마지막으로, 절편을 멸균 증류수로 세 번 헹군 후 다음 배양 배지로 옮겼습니다.
다음 4주 동안, 줄기 재생률, 절편당 줄기 수, 줄기 길이 등 줄기 재생 관련 매개변수를 측정했습니다. 재생된 줄기의 길이가 최소 2cm에 도달했을 때, 1/2 농도의 MS 배지, 0.5mg/L 인돌부티르산(IBA), 0.3% 구아검으로 구성된 발근 배지로 옮겼습니다. 발근 배양은 3주 동안 진행되었으며, 이 기간 동안 발근률, 뿌리 수, 뿌리 길이를 측정했습니다. 각 처리는 3회 반복되었으며, 각 반복마다 10개의 절편을 배양하여 처리당 약 30개의 절편을 얻었습니다.
식물 높이는 자를 사용하여 식물 밑동에서 가장 긴 잎 끝까지 센티미터(cm) 단위로 측정했습니다. 뿌리 길이는 묘목을 조심스럽게 채취하고 배양토를 제거한 직후 밀리미터(mm) 단위로 측정했습니다. 각 식물체에서 눈의 개수를 직접 세었습니다. 잎에 나타나는 검은 반점(결절)의 개수는 육안으로 측정했습니다. 이 검은 결절은 하이페리신을 함유한 분비샘 또는 산화 반점으로 여겨지며, 식물의 처리 반응을 나타내는 생리적 지표로 사용됩니다. 배양토를 모두 제거한 후, 묘목의 생중량은 밀리그램(mg) 단위까지 정확한 전자저울을 사용하여 측정했습니다.
캘러스 형성률 계산 방법은 다음과 같다. 다양한 생장 조절제(키나아제, 2,4-D, Fe3O4)가 포함된 배지에서 식물체를 4주간 배양한 후, 캘러스를 형성할 수 있는 식물체의 수를 세어본다. 캘러스 형성률 계산 공식은 다음과 같다.
각 처리는 3회 반복되었으며, 각 반복에서 최소 10개의 조직 절편을 검사했습니다.
재생률은 캘러스 형성 단계 이후 눈 분화 과정을 성공적으로 완료한 캘러스 조직의 비율을 나타냅니다. 이 지표는 캘러스 조직이 분화된 조직으로 변형되어 새로운 식물 기관으로 성장할 수 있는 능력을 보여줍니다.
발근 계수는 뿌리를 내릴 수 있는 가지의 수와 전체 가지 수의 비율입니다. 이 지표는 발근 단계의 성공률을 반영하며, 이는 조직배양 및 식물 번식에서 매우 중요합니다. 뿌리가 잘 내리면 묘목이 생육 환경에서 더 잘 생존할 수 있기 때문입니다.
히페리신 화합물은 90% 메탄올로 추출하였다. 건조된 식물 재료 50mg을 메탄올 1ml에 넣고 초음파 세척기(모델 A5120-3YJ)를 사용하여 실온에서 어두운 곳에 두고 30kHz에서 20분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 시료를 6000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 Conceiçao 등[14]이 기술한 방법에 따라 Plus-3000 S 분광광도계를 사용하여 592nm에서 히페리신의 흡광도를 측정하였다.
대부분의 식물생장조절제(PGR) 및 산화철 나노입자(Fe₃O₄-NPs) 처리에서 재생된 새순 잎에 검은색 뿌리혹이 형성되지 않았습니다. 2,4-D 0.5mg/L 또는 1mg/L, 키네틴 0.5mg/L 또는 1mg/L, 또는 산화철 나노입자 1mg/L, 2mg/L, 4mg/L를 처리한 경우 뿌리혹이 전혀 관찰되지 않았습니다. 2,4-D(0.5~2mg/L)와 키네틴(1~1.5mg/L), 산화철 나노입자(2~4mg/L)를 조합한 경우처럼 키네틴 및/또는 산화철 나노입자의 농도가 높을수록 뿌리혹 발달이 약간 증가하는 경향을 보였지만(통계적으로 유의미하지는 않음), 이러한 결과는 그림 2에 나타나 있습니다. 검은색 뿌리혹은 자연적으로 발생하는 것과 유익한 것 모두에서 하이페리신이 풍부한 분비샘을 나타냅니다. 본 연구에서 검은색 결절은 주로 조직의 갈변과 관련되어 있으며, 이는 하이페리신 축적에 유리한 환경을 나타냅니다. 2,4-D, 키네틴 및 Fe₃O₄ 나노입자 처리는 캘러스 생장을 촉진하고 갈변을 감소시키며 엽록소 함량을 증가시켜 대사 기능 향상 및 산화 손상 감소 가능성을 시사합니다[37]. 본 연구에서는 키네틴과 2,4-D 및 Fe₃O₄ 나노입자를 병용 처리했을 때 세인트존스워트 캘러스의 생장 및 발달에 미치는 영향을 평가했습니다(그림 3a–g). 이전 연구에서는 Fe₃O₄ 나노입자가 항진균 및 항균 활성을 가지며[38, 39], 식물 생장 조절제와 병용 시 식물 방어 기작을 자극하고 세포 스트레스 지수를 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다[18]. 이차 대사산물의 생합성은 유전적으로 조절되지만, 실제 수율은 환경 조건에 크게 좌우됩니다. 대사 및 형태학적 변화는 특정 식물 유전자의 발현을 조절하고 환경 요인에 반응함으로써 이차 대사산물 수준에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 유도 물질은 새로운 유전자의 활성화를 유발하고, 이는 효소 활성을 자극하여 궁극적으로 여러 생합성 경로를 활성화시키고 이차 대사산물 생성을 촉진합니다. 한 연구에서는 차광을 줄이면 햇빛 노출이 증가하여 히페리쿰 페르포라툼(Hypericum perforatum)의 자연 서식지에서 낮 기온이 상승하고, 이는 히페리신 생산량 증가에 기여한다는 사실을 보여주었습니다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 본 연구에서는 조직 배양에서 철 나노입자의 잠재적 유도 물질로서의 역할을 조사했습니다. 연구 결과, 철 나노입자는 효소 활성 자극을 통해 헤스페리딘 생합성에 관여하는 유전자를 활성화시켜 이 화합물의 축적을 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 2). 따라서 자연 조건에서 자라는 식물과 비교했을 때, 적절한 스트레스와 이차 대사산물 생합성에 관여하는 유전자의 활성화가 결합될 경우 생체 내에서도 이러한 화합물의 생산량이 증가할 수 있다고 주장할 수 있습니다. 일반적으로 복합 처리는 재생률에 긍정적인 영향을 미치지만, 경우에 따라 그 효과가 약화되기도 합니다. 특히, 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L 키나아제, 그리고 다양한 농도의 나노호르몬을 단독으로 처리했을 때, 대조군에 비해 재생률이 50.85% 유의미하게 증가했습니다(그림 4c). 이러한 결과는 나노호르몬의 특정 조합이 식물 생장과 대사산물 생산을 촉진하는 데 시너지 효과를 낼 수 있음을 시사하며, 이는 약용식물의 조직배양에 매우 중요한 의미를 갖습니다. Palmer와 Keller[50]는 2,4-D 처리가 St. perforatum에서 캘러스 형성을 유도할 수 있으며, 키나아제를 첨가하면 캘러스 형성과 재생이 현저히 향상됨을 보여주었습니다. 이러한 효과는 호르몬 균형 개선과 세포 분열 자극에 기인합니다. Bal 등[51]은 Fe₃O₄-NP 처리가 항산화 효소의 기능을 독립적으로 향상시켜 St. perforatum의 뿌리 생장을 촉진할 수 있음을 발견했습니다. 0.5mg/L, 1mg/L, 1.5mg/L 농도의 Fe₃O₄ 나노입자를 함유한 배양액은 아마 식물의 재생률을 향상시켰다[52]. 키네틴, 2,4-디클로로벤조티아졸리논, 그리고 Fe₃O₄ 나노입자를 사용하면 캘러스 및 뿌리 형성률이 크게 향상되지만, 시험관 내 재생에 이러한 호르몬을 사용할 때 발생할 수 있는 잠재적인 부작용을 고려해야 한다. 예를 들어, 2,4-디클로로벤조티아졸리논이나 키네틴을 장기간 또는 고농도로 사용하면 체세포 클론 변이, 산화 스트레스, 비정상적인 캘러스 형태 또는 유리화가 발생할 수 있다. 따라서 높은 재생률이 반드시 유전적 안정성을 의미하는 것은 아니다. 모든 재생 식물은 분자 마커(예: RAPD, ISSR, AFLP) 또는 세포유전학적 분석을 사용하여 동질성과 생체 내 식물과의 유사성을 평가해야 한다[53,54,55].
본 연구는 식물 생장 조절제(2,4-D 및 키네틴)와 Fe₃O₄ 나노입자를 병용했을 때, *Hypericum perforatum*의 형태 형성 및 주요 생리활성 물질(하이페리신, 하이페로사이드 포함)의 축적이 향상됨을 최초로 입증하였다. 최적화된 처리 조건(2,4-D 1 mg/L + 키네틴 1 mg/L + Fe₃O₄-NPs 4 mg/L)은 캘러스 형성, 기관 형성 및 이차 대사산물 수율을 극대화했을 뿐만 아니라, 온화한 유도 효과를 나타내어 식물의 스트레스 내성 및 약효를 향상시킬 가능성을 보여주었다. 나노기술과 식물 조직 배양의 결합은 약용 화합물의 대규모 체외 생산을 위한 지속 가능하고 효율적인 플랫폼을 제공한다. 본 연구 결과는 산업적 응용 및 분자 메커니즘, 투여량 최적화, 유전적 정밀도에 대한 향후 연구를 위한 길을 열어주며, 약용 식물에 대한 기초 연구와 실용적인 생명공학을 연결하는 데 기여할 것이다.
게시 시간: 2025년 12월 12일