줄기 정단 분열 조직(SAM)의 성장은 줄기 구조에 매우 중요합니다. 식물 호르몬지베렐린지베렐린(GA)은 식물 생장 조절에 중요한 역할을 하지만, 줄기 정단 분열 조직(SAM)에서의 역할은 아직 제대로 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 GA 전사 반응에서 필수적인 조절 기능을 억제하면서도 GA 인식 시 분해되도록 DELLA 단백질을 변형하여 GA 신호 전달을 측정하는 비율 측정 바이오센서를 개발했습니다. 이 분해 기반 바이오센서는 발생 과정 중 GA 수준 변화와 세포 감지를 정확하게 기록합니다. 또한, 이 바이오센서를 이용하여 SAM에서 GA 신호 전달 활성을 분석했습니다. 그 결과, 높은 GA 신호는 주로 기관 원기 사이에 위치한 세포, 즉 마디 세포의 전구체에서 나타나는 것을 확인했습니다. 기능 획득 및 기능 상실 실험을 통해 GA가 세포 분열면의 방향을 조절하여 마디의 전형적인 세포 구조를 형성하고, 결과적으로 SAM에서 마디 분화를 촉진한다는 것을 추가적으로 입증했습니다.
줄기 끝에 위치한 정단 분열 조직(SAM)은 줄기 세포들이 모여 있는 곳으로, 이 세포의 활동으로 식물 생애 주기 동안 모듈식 및 반복적인 방식으로 측면 기관과 줄기 마디가 생성됩니다. 이러한 반복 단위, 즉 식물 마디는 마디 사이와 마디에 있는 측면 기관, 그리고 잎겨드랑이에 있는 액생 분열 조직을 포함합니다.1 식물 마디의 성장과 구조는 발달 과정에 따라 변화합니다. 애기장대(Arabidopsis)의 경우, 영양 생장기 동안 마디 사이 성장은 억제되고, 액생 분열 조직은 로제트 잎의 잎겨드랑이에서 휴면 상태로 유지됩니다. 개화기로 전환되는 동안 SAM은 꽃차례 분열 조직이 되어 길쭉한 마디 사이와 액생 눈, 줄기 잎겨드랑이의 작은 가지, 그리고 나중에는 잎이 없는 꽃을 생성합니다.2 잎, 꽃, 가지의 발생을 조절하는 메커니즘에 대해서는 상당한 진전을 이루었지만, 마디가 어떻게 발생하는지에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 적습니다.
지베렐린(GA)의 시공간적 분포를 이해하는 것은 다양한 조직과 발달 단계에서 이러한 호르몬의 기능을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 자체 프로모터의 작용으로 발현되는 RGA-GFP 융합 단백질의 분해를 시각화하면 뿌리에서 총 GA 수준 조절에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.15,16 그러나 RGA 발현은 조직에 따라 다르며17 GA에 의해 조절됩니다.18 따라서 RGA 프로모터의 차등 발현은 RGA-GFP에서 관찰되는 형광 패턴을 유발할 수 있으므로 이 방법은 정량적이지 않습니다. 최근에는 생물학적 활성 플루오레세인(Fl)으로 표지된 GA19,20를 통해 뿌리 내피층에 GA가 축적되고 GA 수송에 의해 세포 내 GA 수준이 조절됨이 밝혀졌습니다. 또한 최근 GA FRET 센서인 nlsGPS1은 뿌리, 필라멘트 및 암조건에서 자란 하배축에서 GA 수준이 세포 신장과 상관관계가 있음을 보여주었습니다.21 그러나 앞서 살펴본 바와 같이, GA 농도는 GA 신호 전달 활성을 조절하는 유일한 매개변수가 아니며, 복잡한 감지 과정에 의존합니다. 본 연구에서는 DELLA 및 GA 신호 전달 경로에 대한 이해를 바탕으로 GA 신호 전달을 정량적으로 측정할 수 있는 분해 기반 비율 측정 바이오센서를 개발하고 특성을 분석했습니다. 이 정량적 바이오센서를 개발하기 위해, 조직 전체에 발현되는 형광 단백질과 융합된 GA 민감성 변이체 RGA와 GA 비민감성 형광 단백질을 사용했습니다. 변이체 RGA 단백질 융합체가 조직 전체에 발현될 때 내인성 GA 신호 전달을 방해하지 않으며, 이 바이오센서가 GA 입력과 감지 장치에 의한 GA 신호 처리로 인한 신호 전달 활성을 높은 시공간 해상도로 정량화할 수 있음을 보여줍니다. 이 바이오센서를 이용하여 GA 신호 전달 활성의 시공간적 분포를 분석하고, SAM 표피에서 GA가 세포 행동을 어떻게 조절하는지 정량화했습니다. 본 연구에서는 GA가 기관 원기 사이에 위치한 SAM 세포의 분열면 방향을 조절하여 마디 사이의 전형적인 세포 구조를 결정한다는 것을 입증합니다.
마지막으로, qmRGA가 성장하는 하배축을 이용하여 내인성 GA 수준의 변화를 보고할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 우리는 이전에 질산염이 GA 합성을 증가시키고 결과적으로 DELLA34 분해를 촉진함으로써 성장을 자극한다는 것을 보여주었습니다. 이에 따라, 풍부한 질산염 공급(10 mM NO₃⁻) 조건에서 자란 pUBQ10::qmRGA 묘목의 하배축 길이가 질산염 결핍 조건에서 자란 묘목보다 유의하게 더 길다는 것을 관찰했습니다(보충 그림 6a). 성장 반응과 일관되게, 10 mM NO₃⁻ 조건에서 자란 묘목의 하배축에서 GA 신호가 질산염이 없는 조건에서 자란 묘목보다 더 높았습니다(보충 그림 6b, c). 따라서 qmRGA는 내인성 GA 농도 변화에 의해 유도되는 GA 신호 전달의 변화를 모니터링하는 데에도 사용할 수 있습니다.
qmRGA로 검출된 GA 신호 전달 활성이 센서 설계에 따라 예상되는 바와 같이 GA 농도 및 GA 인지에 의존하는지 이해하기 위해 영양 조직과 생식 조직에서 세 가지 GID1 수용체의 발현을 분석했습니다. 유묘에서 GID1-GUS 리포터 라인은 GID1a와 c가 자엽에서 높은 수준으로 발현됨을 보여주었습니다(그림 3a–c). 또한, 세 가지 수용체 모두 잎, 측근 원기, 뿌리 끝(GID1b의 뿌리골무 제외), 그리고 관다발 조직에서 발현되었습니다(그림 3a–c). 꽃차례의 SAM에서는 GID1b와 1c에서만 GUS 신호가 검출되었습니다(보충 그림 7a–c). 현장 혼성화(in situ hybridization)를 통해 이러한 발현 양상을 확인했으며, GID1c는 SAM 전체에 걸쳐 낮은 수준으로 균일하게 발현되는 반면, GID1b는 SAM 주변부에서 높은 수준으로 발현됨을 추가로 확인했습니다(보충 그림 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b 번역 융합 단백질은 SAM 중심부에서는 발현이 낮거나 거의 없는 반면, 기관 경계에서는 발현이 높은 GID1b 발현의 단계적 분포를 보여주었습니다(보충 그림 7m). 따라서 GID1 수용체는 조직 전체 및 조직 내에 균일하게 분포되어 있지 않습니다. 후속 실험에서, GID1의 과발현(pUBQ10::GID1a-mCherry)은 하배축에서 외부 GA 처리에 대한 qmRGA의 민감도를 증가시키는 것을 관찰했습니다(그림 3d, e). 대조적으로, 하배축에서 qd17mRGA로 측정한 형광은 GA3 처리에 영향을 받지 않았습니다(그림 3f, g). 두 실험 모두에서, 센서의 빠른 반응을 평가하기 위해 고농도의 GA(100 μM GA3)를 처리하여 GID1 수용체에 결합하는 능력이 향상되거나 소실되는 것을 확인했습니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, qmRGA 바이오센서는 GA 및 GA 센서로서의 기능을 동시에 수행하며, GID1 수용체의 차등 발현이 센서의 발광 특성을 크게 조절할 수 있음을 시사한다.
현재까지 SAM에서 GA 신호의 분포는 불분명합니다. 따라서 우리는 qmRGA를 발현하는 식물과 pCLV3::mCherry-NLS 줄기세포 리포터35를 사용하여 GA 신호 활성의 고해상도 정량 지도를 계산했습니다. 특히 L1층(표피)에 초점을 맞추었는데, L1층은 SAM 성장을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문입니다36. 여기서 pCLV3::mCherry-NLS 발현은 GA 신호 활성의 시공간적 분포를 분석하기 위한 고정된 기하학적 기준점을 제공했습니다37. GA는 측면 기관 발달에 필수적인 것으로 알려져 있지만4, 우리는 P3 단계부터 꽃 원기(P)에서 GA 신호가 낮게 나타나는 것을 관찰했습니다(그림 4a, b). 반면 어린 P1 및 P2 원기에서는 중앙 부위와 유사한 중간 정도의 활성을 보였습니다(그림 4a, b). 기관 원기 경계, 특히 P1/P2(경계 측면)에서 시작하여 P4에서 최고조에 달하는 부위와 원기 사이에 위치한 주변부의 모든 세포에서 높은 GA 신호 활성이 검출되었습니다(그림 4a, b 및 보충 그림 8a, b). 이러한 높은 GA 신호 활성은 표피뿐만 아니라 L2 및 상부 L3 층에서도 관찰되었습니다(보충 그림 8b). qmRGA를 사용하여 SAM에서 검출된 GA 신호 패턴은 시간에 따라 변화 없이 유지되었습니다(보충 그림 8c–f, k). 우리가 자세히 분석한 5개의 독립적인 계통에서 얻은 T3 식물의 SAM에서 qd17mRGA 유전자 구조의 발현이 체계적으로 감소되었음에도 불구하고, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP 유전자 구조를 사용하여 얻은 형광 패턴을 분석할 수 있었습니다(보충 그림 8g–j, l). 이 대조선에서는 SAM에서 형광 비율의 미미한 변화만 감지되었지만, SAM 중심부에서는 TagBFP와 관련된 VENUS의 명확하고 예상치 못한 감소가 관찰되었습니다. 이는 qmRGA로 관찰된 신호 전달 패턴이 mRGA-VENUS의 GA 의존적 분해를 반영한다는 것을 확인시켜 줄 뿐만 아니라, qmRGA가 분열조직 중심부의 GA 신호 전달 활성을 과대평가할 수 있음을 보여줍니다. 요약하면, 우리의 결과는 주로 원기의 분포를 반영하는 GA 신호 전달 패턴을 밝혀냈습니다. 이러한 원기 사이 영역(IPR)의 분포는 발달 중인 원기와 중심 영역 사이에서 높은 GA 신호 전달 활성이 점진적으로 확립되는 반면, 원기 자체의 GA 신호 전달 활성은 감소하는 데 기인합니다(그림 4c, d).
GID1b 및 GID1c 수용체의 분포(위 참조)는 GA 수용체의 차등 발현이 SAM에서 GA 신호 전달 활성 패턴을 형성하는 데 도움이 된다는 것을 시사합니다. 우리는 GA의 차등 축적이 관련되어 있는지 궁금했습니다. 이 가능성을 조사하기 위해 nlsGPS1 GA FRET 센서21를 사용했습니다. 10 μM GA4+7로 100분 동안 처리한 nlsGPS1의 SAM에서 활성화 빈도가 증가하는 것이 관찰되었습니다(보충 그림 9a–e). 이는 nlsGPS1이 뿌리에서와 마찬가지로 SAM에서도 GA 농도 변화에 반응한다는 것을 나타냅니다21. nlsGPS1 활성화 빈도의 공간 분포를 분석한 결과, SAM의 바깥쪽 층에서는 GA 농도가 상대적으로 낮았지만, 중심부와 경계부에서는 높은 수준을 보였습니다(그림 4e 및 보충 그림 9a,c). 이는 GA가 qmRGA에서 나타난 것과 유사한 공간적 패턴으로 SAM에 분포한다는 것을 시사합니다. 보완적인 접근법으로, SAM에 형광 GA(GA3-, GA4-, GA7-Fl) 또는 음성 대조군으로 Fl 단독을 처리했습니다. Fl 신호는 중심 영역과 원시 조직을 포함하여 SAM 전체에 분포했지만, 강도는 더 낮았습니다(그림 4j 및 보충 그림 10d). 대조적으로, 세 가지 GA-Fl 모두 원시 조직 경계 내에 특이적으로 축적되었고, IPR의 나머지 부분에도 다양한 정도로 축적되었으며, GA7-Fl은 IPR에서 가장 넓은 영역에 축적되었습니다(그림 4k 및 보충 그림 10a,b). 형광 강도를 정량화한 결과, GA-Fl 처리 SAM에서 IPR 대 비 IPR 강도 비율이 Fl 처리 SAM보다 더 높았습니다(그림 4l 및 보충 그림 10c). 이러한 결과들을 종합하면, GA는 기관 경계에 가장 가까운 IPR 세포에 더 높은 농도로 존재한다는 것을 시사합니다. 이는 SAM GA 신호 전달 활성 패턴이 GA 수용체의 차등 발현과 기관 경계 부근의 IPR 세포에서 GA 축적의 차등적 변화 모두에 기인한다는 것을 시사합니다. 따라서 우리의 분석은 SAM의 중심부와 원시 부위에서는 활성이 낮고 주변부의 IPR에서는 활성이 높은, 예상치 못한 시공간적 GA 신호 전달 패턴을 밝혀냈습니다.
SAM에서 차별적인 GA 신호 활성의 역할을 이해하기 위해, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS의 실시간 타임랩스 이미징을 이용하여 GA 신호 활성, 세포 팽창 및 세포 분열 간의 상관관계를 분석했습니다. GA가 성장 조절에 관여한다는 점을 고려할 때, 세포 팽창 매개변수와의 양의 상관관계가 예상되었습니다. 따라서, 먼저 GA 신호 활성 지도를 세포 표면 성장률 지도(특정 세포 및 분열 시 딸세포의 세포 팽창 강도를 나타내는 지표) 및 세포 팽창의 방향성을 측정하는 성장 이방성 지도(특정 세포 및 분열 시 딸세포에 대해 사용됨, 그림 5a,b, 방법 및 보충 방법 참조)와 비교했습니다. SAM 세포 표면 성장률 지도는 이전 연구 결과38,39와 일치하며, 경계 부위에서 최소 성장률을, 발달 중인 꽃에서 최대 성장률을 보였습니다(그림 5a). 주성분 분석(PCA) 결과, GA 신호 활성은 세포 표면 성장 강도와 음의 상관관계를 보였다(그림 5c). 또한, GA 신호 입력과 성장 강도를 포함한 주요 변동 축이 높은 CLV3 발현 방향과 직교함을 보여, 나머지 분석에서 SAM 중심부의 세포들이 제외되었음을 확인했다. 스피어만 상관 분석은 PCA 결과를 뒷받침하며(그림 5d), IPR에서 높은 GA 신호가 세포 증식 증가로 이어지지 않음을 나타냈다. 그러나 상관 분석 결과, GA 신호 활성과 성장 이방성 사이에 약한 양의 상관관계가 나타났는데(그림 5c, d), 이는 IPR에서 높은 GA 신호가 세포 성장 방향 및 세포 분열면의 위치에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
a, b 7개의 독립적인 식물에서 평균화된 SAM의 평균 표면 성장(a) 및 성장 이방성(b)의 히트맵(각각 세포 확장의 강도와 방향을 나타내는 지표로 사용됨). c PCA 분석에는 GA 신호, 표면 성장 강도, 표면 성장 이방성 및 CLV3 발현이 포함되었습니다. PCA 구성 요소 1은 주로 표면 성장 강도와 음의 상관관계를, GA 신호와는 양의 상관관계를 보였습니다. PCA 구성 요소 2는 주로 표면 성장 이방성과 양의 상관관계를, CLV3 발현과는 음의 상관관계를 보였습니다. 백분율은 각 구성 요소가 설명하는 변동을 나타냅니다. d CZ를 제외한 조직 규모에서 GA 신호, 표면 성장 강도 및 표면 성장 이방성 간의 스피어만 상관 분석. 오른쪽 숫자는 두 변수 간의 스피어만 rho 값입니다. 별표는 상관관계/음의 상관관계가 매우 유의미한 경우를 나타냅니다. e 공초점 현미경을 이용한 Col-0 SAM L1 세포의 3D 시각화. 10시간 후 SAM(원기 제외)에서 새로 형성된 세포벽은 각도 값에 따라 색이 지정되었습니다. 색상 막대는 오른쪽 하단에 표시되어 있습니다. 삽입 그림은 0시간에서의 해당 3D 이미지를 보여줍니다. 이 실험은 유사한 결과를 얻으며 두 번 반복되었습니다. f 상자 그림은 IPR 및 비IPR Col-0 SAM의 세포 분열 속도를 나타냅니다(n = 10개의 독립적인 식물). 중심선은 중앙값을 나타내고, 상자 경계는 25번째 백분위수와 75번째 백분위수를 나타냅니다. 수염은 R 소프트웨어로 결정된 최소값과 최대값을 나타냅니다. P 값은 Welch의 양측 t-검정을 사용하여 구했습니다. g, h는 (g) SAM 중심(흰색 점선)으로부터 방사 방향에 대한 새로운 세포벽(자홍색)의 각도를 측정하는 방법(예각 값, 즉 0~90°만 고려됨)과 (h) 분열조직 내의 원주/측면 방향 및 방사 방향을 나타내는 개략도입니다. i는 SAM(진한 파란색), IPR(중간 파란색), 비 IPR(밝은 파란색)을 가로지르는 세포 분열면 방향의 빈도 히스토그램입니다. P 값은 양측 Kolmogorov-Smirnov 검정을 통해 얻었습니다. 실험은 유사한 결과를 얻으며 두 번 반복되었습니다. j는 P3(밝은 녹색), P4(중간 녹색), P5(진한 녹색) 주변의 IPR 세포 분열면 방향의 빈도 히스토그램입니다. P 값은 양측 Kolmogorov-Smirnov 검정을 통해 얻었습니다. 실험은 유사한 결과를 얻으며 두 번 반복되었습니다.
따라서 우리는 다음으로 실험 과정에서 새로 형성된 세포벽을 확인하여 GA 신호 전달과 세포 분열 활동 간의 상관관계를 조사했습니다(그림 5e). 이 방법을 통해 세포 분열의 빈도와 방향을 측정할 수 있었습니다. 놀랍게도, IPR과 나머지 SAM(비 IPR, 그림 5f)에서 세포 분열 빈도가 유사한 것으로 나타났는데, 이는 IPR 세포와 비 IPR 세포 간의 GA 신호 전달 차이가 세포 분열에 큰 영향을 미치지 않음을 시사합니다. 이러한 결과와 GA 신호 전달과 성장 이방성 사이의 양의 상관관계를 바탕으로, 우리는 GA 신호 전달 활동이 세포 분열면의 방향에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 고려하게 되었습니다. 우리는 분열조직 중심과 새로운 세포벽 중심을 연결하는 방사축에 대한 예각으로 새로운 세포벽의 방향을 측정했으며(그림 5e-i), 세포들이 방사축에 대해 90°에 가까운 각도로 분열하는 경향이 뚜렷하게 나타났고, 70~80°(23.28%)와 80~90°(22.62%)에서 가장 높은 빈도가 관찰되었다(그림 5e,i). 이는 원주 방향/횡방향으로의 세포 분열에 해당한다(그림 5h). 이러한 세포 분열 행동에 대한 GA 신호 전달의 영향을 조사하기 위해, 우리는 IPR 영역과 비 IPR 영역에서 세포 분열 매개변수를 각각 분석했다(그림 5i). 우리는 IPR 세포의 분열 각도 분포가 비IPR 세포 또는 전체 SAM의 세포 분포와 다르다는 것을 관찰했으며, IPR 세포는 측면/원형 세포 분열, 즉 70~80° 및 80~90°(각각 33.86% 및 30.71%)의 비율이 더 높았습니다(그림 5i). 따라서 우리의 관찰 결과는 높은 GA 신호 전달과 세포 분열면 방향이 원주 방향에 가까운 경향성 사이의 연관성을 보여주었으며, 이는 GA 신호 전달 활성과 성장 이방성 사이의 상관관계와 유사합니다(그림 5c, d). 이러한 연관성의 공간적 보존성을 더욱 확립하기 위해, 우리는 P4부터 가장 높은 GA 신호 전달 활성이 감지된 영역인 P3부터 원시체 주변의 IPR 세포에서 분열면 방향을 측정했습니다(그림 4). P3 및 P4 주변의 IPR 세포 분열 각도는 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았지만, P4 주변의 IPR에서는 측면 세포 분열 빈도가 증가하는 것이 관찰되었다(그림 5j). 그러나 P5 주변의 IPR 세포에서는 세포 분열면의 방향 차이가 통계적으로 유의미해졌으며, 횡방향 세포 분열 빈도가 급격히 증가했다(그림 5j). 이러한 결과들을 종합하면, GA 신호전달이 SAM에서 세포 분열 방향을 조절할 수 있음을 시사하며, 이는 높은 GA 신호전달이 IPR에서 세포 분열의 측면 방향성을 유도한다는 이전 연구 결과40,41와 일치한다.
IPR의 세포는 원기(primordia)가 아닌 마디(internode)에 통합될 것으로 예측됩니다.2,42,43 IPR에서 세포 분열이 가로 방향으로 일어나기 때문에 마디에서 표피 세포가 평행한 세로줄로 배열되는 전형적인 구조가 형성될 수 있습니다. 위에서 설명한 관찰 결과는 GA 신호전달이 세포 분열 방향을 조절함으로써 이 과정에 관여할 가능성이 있음을 시사합니다.
여러 DELLA 유전자의 기능 상실은 지속적인 GA 반응을 유발하며, della 돌연변이체를 이용하여 이 가설을 검증할 수 있다.44 먼저, SAM에서 5개의 DELLA 유전자의 발현 양상을 분석하였다. GUS 계통45의 전사 융합을 통해 GAI, RGA, RGL1, 그리고 RGL2(훨씬 적은 양으로)가 SAM에서 발현됨을 확인하였다(보충 그림 11a–d). 현장 혼성화 분석을 통해 GAI mRNA가 원기 및 발달 중인 꽃에 특이적으로 축적됨을 추가로 확인하였다(보충 그림 11e). RGL1과 RGL3 mRNA는 SAM 전체와 성숙한 꽃에서 검출되었으며, RGL2 mRNA는 경계 부위에서 더 풍부하게 존재하였다(보충 그림 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM의 공초점 현미경 이미징을 통해 현장 혼성화에서 관찰된 발현 양상을 확인하였으며, RGL3 단백질이 SAM의 중심부에 축적됨을 보여주었다(보충 그림 11i). pRGA::GFP-RGA 라인을 사용하여 RGA 단백질이 SAM에 축적되지만 P4부터 경계면에서 그 양이 감소하는 것을 확인했습니다(보충 그림 11j). 특히, RGL3와 RGA의 발현 패턴은 qmRGA로 검출된 IPR에서의 높은 GA 신호 전달 활성과 일치합니다(그림 4). 또한, 이러한 데이터는 모든 DELLA 단백질이 SAM에서 발현되며, 이들의 발현이 SAM 전체에 걸쳐 나타난다는 것을 시사합니다.
다음으로 야생형 SAM(Ler, 대조군)과 gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della 5중(global) 돌연변이체의 세포 분열 매개변수를 분석했습니다(그림 6a, b). 흥미롭게도, della global 돌연변이체 SAM에서 야생형에 비해 세포 분열 각도 빈도 분포에 통계적으로 유의미한 변화가 관찰되었습니다(그림 6c). 이러한 변화는 80~90° 각도(34.71% vs. 24.55%)와 70~80° 각도(23.78% vs. 20.18%)의 빈도 증가, 즉 횡분열에 해당하는 각도의 빈도 증가에 기인했습니다(그림 6c). 또한, della global 돌연변이체에서는 비횡분열(0~60°)의 빈도가 더 낮았습니다(그림 6c). 델라 글로벌 돌연변이체의 SAM에서 횡방향 세포 분열 빈도가 유의하게 증가했습니다(그림 6b). IPR에서의 횡방향 세포 분열 빈도 또한 야생형에 비해 델라 글로벌 돌연변이체에서 더 높았습니다(그림 6d). IPR 영역 외부에서 야생형은 세포 분열 각도의 분포가 더 균일한 반면, 델라 글로벌 돌연변이체는 IPR과 마찬가지로 접선 방향 분열을 선호했습니다(그림 6e). 또한 GA가 축적되는 GA 비활성 돌연변이 배경인 ga2 oxidase(ga2ox) 5중 돌연변이체(ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 및 ga2ox6-2)의 SAM에서 세포 분열 방향을 정량화했습니다. GA 수준 증가와 일관되게, 5중 ga2ox 돌연변이 꽃차례의 SAM은 Col-0보다 크기가 더 컸으며(보충 그림 12a, b), Col-0과 비교했을 때 5중 ga2ox SAM은 세포 분열 각도의 분포가 확연히 달랐는데, 각도 빈도가 50°에서 90°로 증가하여 접선 방향 분열이 더욱 두드러지게 나타났습니다(보충 그림 12a–c). 따라서, GA 신호 전달의 지속적인 활성화와 GA 축적은 IPR과 SAM의 나머지 부분에서 측면 세포 분열을 유도함을 보여줍니다.
a, b PI로 염색된 Ler(a) 및 global della 돌연변이체(b) SAM의 L1 층을 공초점 현미경으로 3D 시각화한 그림입니다. 10시간 동안 SAM(원기 제외)에서 형성된 새로운 세포벽을 각도 값에 따라 색칠하여 보여줍니다. 삽입 그림은 0시간 시점의 SAM을 보여줍니다. 색상 막대는 오른쪽 하단에 표시되어 있습니다. (b)의 화살표는 global della 돌연변이체에서 정렬된 세포열의 예를 가리킵니다. 이 실험은 유사한 결과를 얻으며 두 번 반복되었습니다. c 전체 SAM(d), IPR(e) 및 비 IPR(f)에서 Ler과 global della의 세포 분열면 방향 빈도 분포를 비교한 그림입니다. P 값은 양측 Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 구했습니다. f, g PI로 염색된 Col-0(i) 및 pCUC2::gai-1-VENUS(j) 형질전환 식물의 SAM 공초점 이미지를 3D로 시각화한 그림입니다. 패널 (a, b)는 10시간 이내에 SAM에서 형성된 새로운 세포벽(세포 원기는 제외)을 보여줍니다. 실험은 유사한 결과를 얻으며 두 번 반복되었습니다. h–j는 Col-0과 pCUC2::gai-1-VENUS 식물 간의 전체 SAM(h), IPR(i) 및 비 IPR(j)에 위치한 세포 분열면 방향의 빈도 분포를 비교한 것입니다. P 값은 양측 Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 얻었습니다.
다음으로, IPR에서 GA 신호 전달을 특이적으로 억제했을 때의 효과를 시험했습니다. 이를 위해, 자엽컵 2(CUC2) 프로모터를 이용하여 VENUS에 융합된 우성 음성 gai-1 단백질의 발현을 유도했습니다(pCUC2::gai-1-VENUS 계통). 야생형 SAM에서 CUC2 프로모터는 P4 이후부터 경계 세포를 포함한 SAM 내 대부분의 IPR 발현을 유도하며, pCUC2::gai-1-VENUS 식물에서도 유사한 특이적 발현이 관찰되었습니다(아래 참조). pCUC2::gai-1-VENUS 식물의 SAM 또는 IPR에서 세포 분열 각도의 분포는 야생형과 유의미한 차이가 없었지만, 예상치 못하게 이 식물에서는 IPR이 없는 세포들이 80~90°의 더 높은 빈도로 분열하는 것을 발견했습니다(그림 6f~j).
세포 분열 방향은 SAM의 기하학적 구조, 특히 조직 곡률에 의해 발생하는 인장 응력에 따라 달라진다는 의견이 제시되었습니다.46 따라서 우리는 della global 돌연변이체와 pCUC2::gai-1-VENUS 식물에서 SAM의 형태가 변했는지 여부를 조사했습니다. 이전에 보고된 바와 같이12, della global 돌연변이체의 SAM 크기는 야생형보다 컸습니다(보충 그림 13a, b, d). CLV3 및 STM RNA의 현장 혼성화는 della 돌연변이체에서 분열조직의 확장을 확인했으며, 줄기세포 틈새의 측면 확장도 보여주었습니다(보충 그림 13e, f, h, i). 그러나 SAM의 곡률은 두 유전자형에서 유사했습니다(보충 그림 13k, m, n, p). gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della 사중 돌연변이체에서도 야생형과 비교하여 곡률 변화 없이 크기가 유사하게 증가하는 것을 관찰했습니다(보충 그림 13c, d, g, j, l, o, p). 세포 분열 방향의 빈도 또한 della 사중 돌연변이체에서 영향을 받았지만, della 단일 돌연변이체보다 그 정도는 약했습니다(보충 그림 12d–f). 이러한 용량 효과와 곡률에 대한 영향의 부재는 Della 사중 돌연변이체에서 잔류하는 RGL3 활성이 DELLA 활성 손실로 인한 세포 분열 방향 변화를 제한하고, 측면 세포 분열의 변화는 SAM 기하학적 구조의 변화보다는 GA 신호 전달 활성의 변화에 따라 발생함을 시사합니다. 앞서 설명한 바와 같이, CUC2 프로모터는 P4부터 SAM에서 IPR 발현을 유도합니다(보충 그림 14a, b). 이와 대조적으로, pCUC2::gai-1-VENUS SAM은 크기는 감소했지만 곡률은 증가했습니다(보충 그림 14c–h). 이러한 pCUC2::gai-1-VENUS SAM 형태의 변화는 야생형과 비교하여 기계적 응력 분포의 차이를 초래할 수 있습니다. 야생형에서는 높은 원주 방향 응력이 SAM 중심에서 더 짧은 거리에서 시작됩니다.47 또는, pCUC2::gai-1-VENUS SAM 형태의 변화는 형질전환 유전자 발현에 의해 유도된 국소적 기계적 특성의 변화에서 비롯될 수 있습니다.48 두 경우 모두, 이는 세포가 원주 방향/횡방향으로 분열할 가능성을 높여 GA 신호 전달 변화의 영향을 부분적으로 상쇄할 수 있으며, 이는 우리의 관찰 결과를 설명합니다.
종합적으로 볼 때, 우리의 데이터는 높은 GA 신호 전달이 IPR에서 세포 분열면의 측면 방향 결정에 중요한 역할을 한다는 것을 확인시켜 줍니다. 또한 분열조직의 곡률 또한 IPR에서 세포 분열면의 방향에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.
높은 GA 신호 활성으로 인한 IPR 내 분열면의 횡방향 배열은 GA가 SAM 내 표피에서 방사형 세포열을 미리 조직화하여 나중에 표피 마디에서 발견될 세포 구조를 정의한다는 것을 시사합니다. 실제로 이러한 세포열은 della global 돌연변이체의 SAM 이미지에서 자주 관찰되었습니다(그림 6b). 따라서 SAM에서 GA 신호 전달의 공간적 패턴의 발달 기능을 더 자세히 탐구하기 위해 야생형(Ler 및 Col-0), della global 돌연변이체 및 pCUC2::gai-1-VENUS 형질전환 식물의 IPR에서 세포의 공간적 구조를 분석하기 위해 타임랩스 이미징을 사용했습니다.
우리는 qmRGA 분석 결과 IPR에서 GA 신호 전달 활성이 P1/P2부터 증가하여 P4에 최고조에 달했으며, 이러한 패턴이 시간에 따라 일정하게 유지됨을 확인했습니다(그림 4a–f 및 보충 그림 8c–f, k). GA 신호 증가에 따른 IPR 내 세포들의 공간적 구조를 분석하기 위해, 첫 관찰 후 34시간(엽록체 시간 2배 이상)이 지난 시점에서 분석한 발생 운명에 따라 P4 위쪽과 측면에 있는 Ler IPR 세포들을 표지했습니다. 이를 통해 P1/P2부터 P4까지 원시세포 발달 과정 동안 IPR 세포들을 추적할 수 있었습니다. 세 가지 색상을 사용했는데, P4 근처에서 원시세포에 통합된 세포는 노란색, IPR에 존재하는 세포는 녹색, 그리고 두 과정 모두에 참여한 세포는 보라색으로 표시했습니다(그림 7a–c). t0(0시간)에는 P4 앞쪽에 1~2층의 IPR 세포들이 관찰되었습니다(그림 7a). 예상대로, 이 세포들은 분열할 때 주로 횡분열면을 통해 분열했습니다(그림 7a–c). Col-0 SAM을 사용했을 때도 비슷한 결과가 얻어졌습니다(Ler의 P4와 유사하게 경계가 접히는 P3에 초점을 맞추어 분석). 다만 이 유전자형에서는 꽃 가장자리에 형성된 주름이 IPR 세포를 더 빨리 가렸습니다(그림 7g–i). 따라서 IPR 세포의 분열 패턴은 세포들을 마디 사이처럼 방사형으로 배열합니다. 방사형 배열의 구조와 연속적인 기관 사이에 IPR 세포가 위치하는 것은 이 세포들이 마디 사이 전구 세포임을 시사합니다.
본 연구에서는 GA와 GA 수용체 농도의 복합적인 영향으로 발생하는 GA 신호 활성을 정량적으로 측정할 수 있으면서도 내인성 신호 전달 경로와의 간섭을 최소화하는 비율 측정 GA 신호 전달 바이오센서인 qmRGA를 개발하여 세포 수준에서 GA 기능에 대한 정보를 제공하고자 했습니다. 이를 위해 DELLA 상호작용 파트너와의 결합 능력은 상실했지만 GA 유도 단백질 분해에는 민감한 변형 DELLA 단백질인 mRGA를 제작했습니다. qmRGA는 외인성 및 내인성 GA 농도 변화 모두에 반응하며, 동적 감지 특성을 통해 발생 과정 중 GA 신호 활성의 시공간적 변화를 평가할 수 있습니다. 또한, qmRGA는 발현에 사용되는 프로모터를 변경하여 다양한 조직에 적용할 수 있는 유연성을 지니고 있으며, 속씨식물 전반에 걸쳐 GA 신호 전달 경로와 PFYRE 모티프가 보존되어 있다는 점을 고려할 때 다른 종에도 적용 가능할 것으로 예상됩니다.22 이와 일관되게, 벼 SLR1 DELLA 단백질의 동일한 돌연변이(HYY497AAA) 또한 SLR1의 생장 억제 활성을 억제하는 반면, mRGA23과 유사하게 GA 매개 분해는 약간만 감소시키는 것으로 나타났습니다. 특히, 최근 애기장대 연구에서는 PFYRE 도메인의 단일 아미노산 돌연변이(S474L)가 전사 인자 파트너와의 상호작용 능력에는 영향을 미치지 않으면서 RGA의 전사 활성을 변화시키는 것으로 나타났습니다50. 이 돌연변이는 mRGA에 존재하는 3개의 아미노산 치환과 매우 유사하지만, 본 연구 결과는 이 두 돌연변이가 DELLA의 서로 다른 특성을 변화시킨다는 것을 보여줍니다. 대부분의 전사 인자 파트너는 DELLA26,51의 LHR1 및 SAW 도메인에 결합하지만, PFYRE 도메인의 일부 보존된 아미노산은 이러한 상호작용을 안정화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
마디 발달은 식물 구조 및 수확량 증진에 있어 핵심적인 형질입니다. qmRGA 분석 결과, IPR 마디 전구 세포에서 GA 신호 전달 활성이 더 높은 것으로 나타났습니다. 정량적 이미징과 유전학을 결합하여, GA 신호 전달 패턴이 SAM 표피에서 원형/횡방향 세포 분열면을 중첩시켜 마디 발달에 필요한 세포 분열 구조를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 세포 분열면 방향을 조절하는 여러 조절인자가 발달 과정에서 확인되었습니다.52,53 본 연구는 GA 신호 전달 활성이 이러한 세포 매개변수를 어떻게 조절하는지에 대한 명확한 사례를 제시합니다. DELLA는 단백질 접힘 전 복합체와 상호작용할 수 있으므로, GA 신호 전달은 피질 미세소관 방향에 직접적인 영향을 미쳐 세포 분열면 방향을 조절할 수 있습니다.41,40,41,54,55 본 연구에서는 SAM에서 GA 신호 전달 활성이 높을수록 세포 신장이나 분열이 아닌 성장 이방성만 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 GA가 IPR에서 세포 분열 방향에 직접적인 영향을 미친다는 기존 연구 결과와 일치합니다. 그러나 이러한 효과가 GA 유도 세포벽 연화56와 같은 간접적인 기전을 통해 나타날 가능성도 배제할 수 없습니다. 세포벽 특성의 변화는 기계적 스트레스를 유발하며57,58, 이는 피질 미세소관의 방향에 영향을 미쳐 세포 분열면의 방향에도 영향을 줄 수 있습니다39,46,59. GA 유도 기계적 스트레스와 GA에 의한 미세소관 방향의 직접적인 조절이 복합적으로 작용하여 IPR에서 특정 세포 분열 방향 패턴을 생성하고 마디를 정의하는 데 관여할 수 있으며, 이를 검증하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 마찬가지로, 이전 연구에서는 마디 형성 조절에 있어 DELLA 상호작용 단백질인 TCP14와 15의 중요성을 강조했으며60,61, 이들 인자는 마디 발달을 조절하고 GA 신호 전달에 영향을 미치는 것으로 알려진 BREVIPEDICELLUS(BP) 및 PENNYWISE(PNY)와 함께 GA의 작용을 매개할 수 있습니다2,62. DELLA가 브라시노스테로이드, 에틸렌, 자스몬산 및 앱시식산(ABA) 신호 전달 경로63,64와 상호 작용하고 이러한 호르몬이 미세소관 방향에 영향을 줄 수 있다는 점을 고려할 때65, 세포 분열 방향에 대한 GA의 효과는 다른 호르몬에 의해서도 매개될 수 있습니다.
초기 세포학 연구에 따르면 아라비도프시스 SAM의 내부와 외부 영역 모두 마디 발달에 필수적이라는 사실이 밝혀졌습니다.2,42 GA가 내부 조직의 세포 분열을 적극적으로 조절한다는 사실은12 SAM에서 분열조직과 마디 크기를 조절하는 GA의 이중 기능을 뒷받침합니다. 방향성 세포 분열 패턴 또한 SAM 내부 조직에서 엄격하게 조절되며, 이러한 조절은 줄기 생장에 필수적입니다.52 GA가 SAM 내부 조직에서 세포 분열면의 방향을 결정하는 데에도 관여하여 SAM 내 마디의 분화 및 발달을 동기화하는지 여부를 조사하는 것은 흥미로울 것입니다.
식물은 표준 조건(16시간 광주기, 22°C)에서 토양 또는 1% 수크로오스와 1% 한천(Sigma)이 첨가된 1x Murashige-Skoog(MS) 배지(Duchefa)에서 시험관 내 재배하였다. 단, 하배축 및 뿌리 생장 실험의 경우, 묘목을 수직 배양 접시에서 지속적인 광주기 및 22°C 조건으로 재배하였다. 질산염 실험의 경우, 식물은 적절한 질산염(0 또는 10 mM KNO₃), 0.5 mM NH₄-숙신산염, 1% 수크로오스 및 1% A-한천(Sigma)이 첨가된 변형 MS 배지(bioWORLD 식물 배지)에서 장일 조건으로 재배하였다.
pDONR221에 삽입된 GID1a cDNA는 pDONR P4-P1R-pUBQ10 및 pDONR P2R-P3-mCherry와 재조합되어 pB7m34GW를 생성하여 pUBQ10::GID1a-mCherry를 생성하였다. pDONR221에 삽입된 IDD2 DNA는 pB7RWG266과 재조합되어 p35S:IDD2-RFP를 생성하였다. pGID1b::2xmTQ2-GID1b를 생성하기 위해, 먼저 GID1b 코딩 영역 상류의 3.9kb 단편과 GID1b cDNA(1.3kb) 및 종결자(3.4kb)를 포함하는 4.7kb 단편을 보충표 3의 프라이머를 사용하여 증폭한 다음, 각각 pDONR P4-P1R(Thermo Fisher Scientific) 및 pDONR P2R-P3(Thermo Fisher Scientific)에 삽입하고, 마지막으로 Gateway 클로닝을 사용하여 pDONR221 2xmTQ268과 재조합하여 pGreen 012567 표적 벡터에 삽입하였다. pCUC2::LSSmOrange를 생성하기 위해, CUC2 프로모터 서열(ATG 상류 3229 bp)과 N7 핵 위치 신호 및 NOS 전사 종결 서열을 포함하는 대형 스토크스 시프트 mOrange(LSSmOrange)69의 코딩 서열을 Gateway 3-fragment 재조합 시스템(Invitrogen)을 이용하여 pGreen 카나마이신 타겟팅 벡터에 조립하였다. 이 식물 이진 벡터를 Agrobacterium tumefaciens GV3101 균주에 도입하고, Agrobacterium 침투법을 이용하여 Nicotiana benthamiana 잎에, 그리고 화분침지법을 이용하여 Arabidopsis thaliana Col-0에 각각 도입하였다. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry 및 pCLV3::mCherry-NLS qmRGA는 각각의 교배에서 얻은 F3 및 F1 자손으로부터 분리하였다.
약 1cm 길이의 새순 끝부분72을 채취하여 즉시 4°C로 예냉된 FAA 용액(3.7% 포름알데히드, 5% 아세트산, 50% 에탄올)에 고정시킨 후 RNA 현장 혼성화(in situ hybridization)를 수행하였다. 15분씩 두 번 진공 처리한 후 고정액을 교체하고 시료를 하룻밤 동안 배양하였다. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 및 RGL3 cDNA와 이들의 3'-UTR에 대한 안티센스 프로브는 Rosier et al.73에 설명된 바와 같이 보충표 3에 제시된 프라이머를 사용하여 합성하였다. 디곡시게닌으로 표지된 프로브는 디곡시게닌 항체(3000배 희석; Roche, 카탈로그 번호: 11 093 274 910)를 사용하여 면역 검출하였고, 절편은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP, 250배 희석)/니트로블루 테트라졸륨(NBT, 200배 희석) 용액으로 염색하였다.
게시 시간: 2025년 2월 10일