줄기 정단 분열조직(SAM)의 성장은 줄기 구조에 매우 중요합니다. 식물 호르몬지베렐린(GA)는 식물 생장을 조절하는 데 중요한 역할을 하지만, SAM에서의 역할은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 DELLA 단백질을 조작하여 GA 전사 반응에서 필수적인 조절 기능을 억제하는 동시에 GA 인식 시 분해되는 특성을 유지하도록 GA 신호전달의 비율계량적 바이오센서를 개발했습니다. 이 분해 기반 바이오센서가 발달 과정 중 GA 수치 변화와 세포 감지를 정확하게 기록함을 보여줍니다. 또한, 이 바이오센서를 사용하여 SAM에서 GA 신호전달 활성을 측정했습니다. 높은 GA 신호는 주로 절간 세포의 전구체인 기관 원기 사이에 위치한 세포에서 발견됩니다. 기능 획득 및 기능 상실 접근법을 통해 GA가 세포 분열 평면의 방향을 조절하여 절간 세포의 표준 세포 조직을 확립하고, 이를 통해 SAM에서 절간 분화를 촉진함을 추가로 입증했습니다.
줄기 정단에 위치한 줄기 정단 분열조직(SAM)은 줄기 세포들이 모여 있는 공간을 포함하고 있으며, 이 줄기 세포들의 활동은 식물의 생애 전반에 걸쳐 모듈적이고 반복적으로 측부 기관과 줄기 마디를 생성합니다. 이러한 반복 단위, 즉 식물 마디는 마디에 마디간과 측부 기관, 그리고 잎겨드랑이에 곁가지 분열조직을 포함합니다.1 식물 마디의 성장과 조직은 발달 과정에서 변화합니다. 애기장대에서 영양생장기에는 마디간 생장이 억제되고, 곁가지 분열조직은 로제트 잎의 겨드랑이에서 휴면 상태를 유지합니다. 꽃 단계로 전환되는 동안 SAM은 꽃차례 분열조직이 되어 길쭉한 마디간과 곁눈, 줄기 잎의 겨드랑이에 작은 가지, 그리고 나중에는 잎이 없는 꽃을 생성합니다.2 잎, 꽃, 가지의 발생을 제어하는 기전을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었지만, 마디간이 어떻게 발생하는지에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 적습니다.
GA의 시공간적 분포를 이해하면 다양한 조직과 발달 단계에서 이러한 호르몬의 기능을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 자체 프로모터의 작용으로 발현되는 RGA-GFP 융합 단백질의 분해 과정을 시각화하면 뿌리의 총 GA 수준 조절에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.15,16 그러나 RGA 발현은 조직에 따라 다르며17 GA에 의해 조절됩니다.18 따라서 RGA 프로모터의 발현 차이는 RGA-GFP에서 관찰되는 형광 패턴을 초래할 수 있으므로 이 방법은 정량적이지 않습니다. 최근 생리활성 플루오레세인(Fl)으로 표지된 GA19,20는 뿌리 내피질에 GA가 축적되고 GA 수송을 통해 세포 수준이 조절됨을 보여주었습니다. 최근 GA FRET 센서 nlsGPS1은 GA 수준이 뿌리, 사상체, 그리고 암흑에서 자란 하배축의 세포 신장과 상관관계가 있음을 보여주었습니다.21 그러나 앞서 살펴본 바와 같이, GA 농도는 복잡한 감지 과정에 의존하기 때문에 GA 신호전달 활성을 제어하는 유일한 매개변수는 아닙니다. 본 연구에서는 DELLA 및 GA 신호전달 경로에 대한 이해를 바탕으로, GA 신호전달을 위한 분해 기반 비율계량 바이오센서의 개발 및 특성 분석을 보고합니다. 이 정량적 바이오센서를 개발하기 위해, 형광 단백질과 융합되어 조직 내 편재적으로 발현되는 돌연변이 GA 민감성 RGA와 GA 비민감성 형광 단백질을 사용했습니다. 돌연변이 RGA 단백질 융합체가 편재적으로 발현될 때 내인성 GA 신호전달을 방해하지 않으며, 이 바이오센서가 감지 장치에 의한 GA 입력 및 GA 신호 처리 모두에서 발생하는 신호전달 활성을 높은 시공간적 분해능으로 정량화할 수 있음을 보였습니다. 이 바이오센서를 사용하여 GA 신호전달 활성의 시공간적 분포를 매핑하고, GA가 SAM 표피에서 세포 행동을 조절하는 방식을 정량화했습니다. 우리는 GA가 기관 원시세포 사이에 위치한 SAM 세포의 분열 평면의 방향을 조절하여 마디 사이의 표준 세포 조직을 정의한다는 것을 보여줍니다.
마지막으로, qmRGA가 성장하는 하배축을 이용하여 내인성 GA 수치 변화를 보고할 수 있는지 알아보았습니다. 이전에 질산염이 GA 합성을 증가시키고, 나아가 DELLA34 분해를 촉진하여 생장을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 따라서, 풍부한 질산염 공급(10 mM NO3−) 하에서 자란 pUBQ10::qmRGA 유묘의 하배축 길이가 질산염 결핍 조건에서 자란 유묘보다 유의하게 길었음을 관찰했습니다(보충 그림 6a). 이러한 생장 반응과 일치하게, 질산염이 없는 조건에서 자란 유묘보다 10 mM NO3− 조건에서 자란 유묘의 하배축에서 GA 신호가 더 높았습니다(보충 그림 6b, c). 따라서 qmRGA는 GA 농도의 내인성 변화에 의해 유도되는 GA 신호 전달의 변화도 모니터링할 수 있습니다.
센서 설계에 기반하여 예상한 대로 qmRGA에서 검출된 GA 신호 전달 활동이 GA 농도와 GA 인지에 의존하는지 이해하기 위해 영양 조직과 생식 조직에서 세 가지 GID1 수용체의 발현을 분석했습니다.묘목에서 GID1-GUS 리포터 라인은 GID1a와 c가 자엽에서 높게 발현되는 것을 보여주었습니다(그림 3a–c).또한 세 가지 수용체 모두 잎, 측근 원기, 뿌리 끝(GID1b의 뿌리꼭지 제외), 그리고 혈관계에서 발현되었습니다(그림 3a–c).화서 SAM에서 GID1b와 1c에 대해서만 GUS 신호를 검출했습니다(보충 그림 7a–c).현장 교잡법으로 이러한 발현 패턴을 확인하고 GID1c가 SAM에서 낮은 수준으로 균일하게 발현되는 반면 GID1b는 SAM 주변에서 더 높은 발현을 보였다는 것을 추가로 보여주었습니다(보충 그림 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b 번역 융합은 또한 SAM 중앙에서 발현이 낮거나 전혀 없는 것부터 기관 경계에서 발현이 높은 것까지 GID1b 발현의 단계적 범위를 보여주었습니다(보충 그림 7m). 따라서 GID1 수용체는 조직 전체와 조직 내에서 균일하게 분포되지 않습니다. 후속 실험에서 GID1(pUBQ10::GID1a-mCherry)의 과발현이 하배축에서 외부 GA 적용에 대한 qmRGA의 민감도를 증가시키는 것을 관찰했습니다(그림 3d, e). 반면, 하배축에서 qd17mRGA로 측정한 형광은 GA3 처리에 민감하지 않았습니다(그림 3f, g). 두 분석 모두에서, 묘목에 고농도의 GA(100 μM GA3)를 처리하여 센서의 빠른 거동을 평가했는데, GID1 수용체에 결합하는 능력이 향상되거나 상실되었습니다. 이러한 결과를 종합해 보면 qmRGA 바이오센서가 GA와 GA 센서로서 결합된 기능을 수행한다는 것이 확인되었으며, GID1 수용체의 차등 발현이 센서의 방출률을 상당히 조절할 수 있음을 시사합니다.
현재까지 SAM에서 GA 신호의 분포는 불분명합니다. 따라서 qmRGA를 발현하는 식물체와 pCLV3::mCherry-NLS 줄기세포 리포터35를 사용하여 L1층(표피, 그림 4a, b, 방법 및 보충 방법 참조)에 초점을 맞춰 GA 신호 활성의 고해상도 정량 지도를 계산했습니다. L1은 SAM 생장 조절에 중요한 역할을 하기 때문입니다36. 여기서 pCLV3::mCherry-NLS 발현은 GA 신호 활성의 시공간적 분포를 분석하기 위한 고정된 기하학적 기준점을 제공했습니다37. GA는 측면 기관 발달에 필수적인 것으로 여겨지지만, P3 단계부터 시작하는 꽃 원기(P)에서는 GA 신호가 낮았지만(그림 4a, b), 어린 P1 및 P2 원기에서는 중앙 영역과 유사한 중간 정도의 활성을 보였습니다(그림 4a, b). 더 높은 GA 신호 전달 활성은 기관 원시 세포 경계에서 검출되었으며, 경계의 양쪽에 있는 P1/P2에서 시작하여 P4에서 정점을 이루었고, 원시 세포 사이에 위치한 주변 영역의 모든 세포에서도 검출되었습니다(그림 4a, b 및 보충 그림 8a, b). 이 더 높은 GA 신호 전달 활성은 표피뿐만 아니라 L2 및 상위 L3 층에서도 관찰되었습니다(보충 그림 8b). qmRGA를 사용하여 SAM에서 검출된 GA 신호의 패턴도 시간이 지나도 변하지 않았습니다(보충 그림 8c–f, k). qd17mRGA 구조는 우리가 자세히 특성화한 다섯 개의 독립적인 계통에서 T3 식물의 SAM에서 체계적으로 하향 조절되었지만, 우리는 pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP 구조로 얻은 형광 패턴을 분석할 수 있었습니다(보충 그림 8g–j, l). 이 대조군에서는 SAM에서 형광 비율의 미미한 변화만 감지되었지만, SAM 중심에서는 TagBFP와 관련된 VENUS의 명확하고 예상치 못한 감소를 관찰했습니다. 이는 qmRGA에서 관찰된 신호 전달 패턴이 mRGA-VENUS의 GA 의존적 분해를 반영함을 확인시켜 주지만, qmRGA가 분열조직 중심에서 GA 신호 전달 활성을 과대평가할 수 있음을 보여줍니다. 요약하자면, 본 연구의 결과는 주로 원시체의 분포를 반영하는 GA 신호 전달 패턴을 보여줍니다. 이러한 원시체 간 영역(IPR)의 분포는 발달 중인 원시체와 중심 영역 사이에 높은 GA 신호 전달 활성이 점진적으로 확립되는 반면, 동시에 원시체의 GA 신호 전달 활성은 감소하기 때문입니다(그림 4c, d).
GID1b 및 GID1c 수용체의 분포(위 참조)는 GA 수용체의 차등 발현이 SAM에서 GA 신호 전달 활동 패턴을 형성하는 데 도움이 됨을 시사합니다. 우리는 GA의 차등 축적이 관련될 수 있는지 궁금했습니다. 이 가능성을 조사하기 위해 nlsGPS1 GA FRET 센서21를 사용했습니다. 100분 동안 10 μM GA4+7로 처리한 nlsGPS1의 SAM에서 활성화 빈도가 증가했습니다(보충 그림 9a–e). 이는 nlsGPS1이 뿌리에서와 마찬가지로 SAM의 GA 농도 변화에 반응함을 나타냅니다21. nlsGPS1 활성화 빈도의 공간적 분포는 SAM의 바깥층에서 GA 수준이 비교적 낮았지만 SAM의 중앙과 경계에서는 증가했음을 보여주었습니다(그림 4e 및 보충 그림 9a,c). 이는 GA가 qmRGA에서 드러난 것과 비슷한 공간적 패턴으로 SAM에도 분포함을 시사합니다. 보완적 접근법으로서, 우리는 SAM을 형광성 GA(GA3-, GA4-, GA7-Fl) 또는 음성 대조군으로 Fl만을 처리했습니다. Fl 신호는 중앙 영역과 원시체를 포함한 SAM 전체에 분포했지만 강도는 낮았습니다(그림 4j 및 보충 그림 10d). 대조적으로, 세 가지 GA-Fl 모두 원시체 경계 내에 특이적으로 축적되었고 나머지 IPR에서는 다양한 정도로 축적되었으며, GA7-Fl은 IPR에서 가장 큰 영역에 축적되었습니다(그림 4k 및 보충 그림 10a, b). 형광 강도를 정량화한 결과, GA-Fl로 처리한 SAM에서 IPR 대 비IPR 강도 비율이 Fl로 처리한 SAM에 비해 더 높았습니다(그림 4l 및 보충 그림 10c). 이러한 결과를 종합하면, GA는 기관 경계에 가장 가까운 IPR 세포에서 더 높은 농도로 존재함을 시사합니다. 이는 SAM GA 신호전달 활성 패턴이 GA 수용체의 차등 발현과 기관 경계 근처 IPR 세포에서의 GA 축적 차이에 기인함을 시사한다. 따라서 본 분석 결과, SAM의 중심부와 원기에서는 활성이 낮고 말초부에서는 IPR의 활성이 높은, 예상치 못한 시공간적 GA 신호전달 패턴이 확인되었다.
SAM에서 차등 GA 신호전달 활성의 역할을 이해하기 위해, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS의 실시간 타임랩스 영상을 이용하여 GA 신호전달 활성, 세포 증식, 그리고 세포 분열 간의 상관관계를 분석했습니다. 성장 조절에서 GA의 역할을 고려할 때, 세포 증식 매개변수와 양의 상관관계가 예상되었습니다. 따라서, 먼저 GA 신호전달 활성 지도를 세포 표면 성장률 지도(주어진 세포와 분열 시 딸세포의 세포 증식 강도를 나타내는 지표) 및 세포 증식의 방향을 측정하는 성장 이방성 지도(주어진 세포와 분열 시 딸세포에도 사용됨; 그림 5a, b, 방법 및 보충 방법 참조)와 비교했습니다. SAM 세포 표면 성장률 지도는 경계에서 최소 성장률을, 발달 중인 꽃에서 최대 성장률을 나타내는 등 기존 관찰 결과38,39와 일치했습니다(그림 5a). 주성분 분석(PCA) 결과, GA 신호전달 활성은 세포 표면 성장 강도와 음의 상관관계를 보였습니다(그림 5c). 또한 GA 신호전달 입력과 성장 강도를 포함한 주요 변이 축이 높은 CLV3 발현에 의해 결정된 방향과 직교함을 확인하여 나머지 분석에서 SAM 중심에서 세포가 제외되었음을 확인했습니다. 스피어만 상관분석 결과도 PCA 결과를 뒷받침했습니다(그림 5d). 이는 IPR에서 높은 GA 신호가 세포 증식을 증가시키지 않음을 나타냅니다. 그러나 상관분석 결과, GA 신호전달 활성과 성장 이방성 사이에 약간의 양의 상관관계가 나타났습니다(그림 5c, d). 이는 IPR에서 높은 GA 신호전달이 세포 성장 방향과 세포 분열 평면의 위치에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.
a, b 7개의 독립된 식물체에 대해 평균한 SAM의 평균 표면 성장(a)과 성장 이방성(b)의 열지도(각각 세포 확장의 강도와 방향을 나타내는 대리 변수로 사용됨).c PCA 분석에는 다음 변수가 포함되었습니다.GA 신호, 표면 성장 강도, 표면 성장 이방성 및 CLV3 발현.PCA 구성 요소 1은 주로 표면 성장 강도와 음의 상관관계를 보였고 GA 신호와 양의 상관관계를 보였습니다.PCA 구성 요소 2는 주로 표면 성장 이방성과 양의 상관관계를 보였고 CLV3 발현과 음의 상관관계를 보였습니다.백분율은 각 구성 요소에 의해 설명되는 변동을 나타냅니다.d CZ를 제외한 조직 규모에서 GA 신호, 표면 성장 강도 및 표면 성장 이방성 간의 스피어만 상관 분석.오른쪽의 숫자는 두 변수 간의 스피어만 로 값입니다.별표는 상관관계/음의 상관관계가 매우 유의한 경우를 나타냅니다.e 공초점 현미경을 이용한 Col-0 SAM L1 세포의 3D 시각화. 10시간에 SAM(원시세포는 아님)에서 형성된 새로운 세포벽을 각도 값에 따라 색상으로 표시했습니다. 색상 막대는 오른쪽 하단에 표시되어 있습니다. 삽입 그림은 0시간에 해당하는 3D 이미지를 보여줍니다. 실험은 두 번 반복하여 비슷한 결과를 얻었습니다. f 상자 그림은 IPR 및 비IPR Col-0 SAM(n = 10 독립 식물)에서의 세포 분열 속도를 보여줍니다. 중심선은 중앙값을, 상자 경계는 25번째 및 75번째 백분위수를 나타냅니다. 수염은 R 소프트웨어로 측정한 최소값과 최대값을 나타냅니다. P 값은 웰치의 양측 t-검정을 사용하여 얻었습니다. g, h (g) SAM(흰 점선)의 중심으로부터 방사 방향에 대한 새로운 세포벽(마젠타)의 각도를 측정하는 방법(예각 값, 즉 0~90°만 고려)과 분열조직 내의 원주/측면 및 방사 방향을 보여주는 개략도. i SAM(짙은 파란색), IPR(중간 파란색), 비IPR(연한 파란색)을 각각 가로지르는 세포 분열 평면 방향의 빈도 히스토그램. P 값은 양측 콜모고로프-스미르노프 검정으로 얻었습니다. 실험은 두 번 반복하여 비슷한 결과를 얻었습니다. j P3(연한 녹색), P4(중간 녹색), P5(짙은 녹색)를 각각 중심으로 하는 IPR의 세포 분열 평면 방향의 빈도 히스토그램. P 값은 양측 콜모고로프-스미르노프 검정으로 얻었습니다. 실험은 두 번 반복하여 비슷한 결과를 얻었습니다.
따라서, 본 연구에서는 분석 과정에서 새롭게 형성된 세포벽을 확인하여 GA 신호전달과 세포 분열 활성 사이의 상관관계를 조사했습니다(그림 5e). 이 접근법을 통해 세포 분열의 빈도와 방향을 측정할 수 있었습니다. 놀랍게도, IPR과 SAM의 나머지 부분(비IPR, 그림 5f)에서 세포 분열 빈도가 유사함을 확인했습니다. 이는 IPR 세포와 비IPR 세포 간의 GA 신호전달 차이가 세포 분열에 유의미한 영향을 미치지 않음을 시사합니다. 이러한 결과와 GA 신호전달과 성장 이방성 사이의 양의 상관관계를 통해, GA 신호전달 활성이 세포 분열 평면의 방향에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 검토하게 되었습니다. 분열조직 중심과 새로운 세포벽 중심을 연결하는 방사축에 대해 예각으로 새로운 세포벽의 방향을 측정한 결과(그림 5e-i), 방사축에 대해 90°에 가까운 각도에서 세포 분열이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인했습니다. 특히 70~80°(23.28%)와 80~90°(22.62%)에서 가장 높은 빈도를 보였으며(그림 5e,i), 이는 원주/횡방향 세포 분열에 해당합니다(그림 5h). 이러한 세포 분열 양상에 대한 GA 신호전달의 기여도를 알아보기 위해, IPR 및 비IPR 환경에서 세포 분열 매개변수를 각각 분석했습니다(그림 5i). 우리는 IPR 세포의 분열 각도 분포가 비IPR 세포 또는 전체 SAM의 세포와 다르다는 것을 관찰했으며, IPR 세포는 측면/원형 세포 분열의 비율이 더 높았습니다.즉, 70-80° 및 80-90°(각각 33.86% 및 30.71%, 해당 비율)(그림 5i).따라서 우리의 관찰은 높은 GA 신호 전달과 원주 방향에 가까운 세포 분열 평면 방향 사이의 연관성을 밝혀냈으며, 이는 GA 신호 전달 활성과 성장 이방성 사이의 상관관계와 유사합니다(그림 5c, d).이 연관성의 공간적 보존을 더욱 확립하기 위해, 가장 높은 GA 신호 전달 활성이 P4부터 이 영역에서 검출되었기 때문에(그림 4) P3부터 시작하여 원시체를 둘러싼 IPR 세포의 분열 평면 방향을 측정했습니다. P3와 P4 주변의 IPR 분열 각도는 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았으나, P4 주변의 IPR에서는 세포 측방 분열 빈도가 증가하였다(그림 5j). 그러나 P5 주변의 IPR 세포에서는 세포 분열면의 방향 차이가 통계적으로 유의미하게 나타났으며, 횡분열 빈도가 급격히 증가하였다(그림 5j). 이러한 결과는 GA 신호전달이 SAM에서 세포 분열의 방향을 조절할 수 있음을 시사하며, 이는 높은 GA 신호전달이 IPR에서 세포 분열의 측방 분열을 유도할 수 있다는 기존 보고40,41와 일치한다.
IPR의 세포들은 원기(primordia)가 아닌 절간(internode)으로 통합될 것으로 예측된다(2,42,43). IPR에서 세포 분열이 횡방향으로 진행됨에 따라 절간에서 표피 세포들이 평행한 세로줄로 배열되는 전형적인 형태가 나타날 수 있다. 앞서 설명한 관찰 결과는 GA 신호전달이 세포 분열 방향을 조절함으로써 이 과정에 중요한 역할을 할 가능성이 있음을 시사한다.
여러 DELLA 유전자의 기능 상실은 구성적 GA 반응을 초래하며, della 돌연변이는 이 가설을 검증하는 데 사용될 수 있습니다.44 먼저 SAM에서 5가지 DELLA 유전자의 발현 패턴을 분석했습니다. GUS 세포주45의 전사 융합을 통해 GAI, RGA, RGL1, RGL2(훨씬 낮은 수준으로)가 SAM에서 발현됨을 확인했습니다(보충 그림 11a–d). 현장 교잡법을 통해 GAI mRNA가 원기(primordia)와 발달 중인 꽃에 특이적으로 축적됨이 추가로 입증되었습니다(보충 그림 11e). RGL1과 RGL3 mRNA는 SAM 수관 전체와 오래된 꽃에서 검출된 반면, RGL2 mRNA는 경계 영역에서 더 풍부했습니다(보충 그림 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM의 공초점 이미징은 현장 교잡법에서 관찰된 발현을 확인하고 RGL3 단백질이 SAM의 중앙 부분에 축적됨을 보여주었습니다(보충 그림 11i). pRGA::GFP-RGA 계통을 이용하여 RGA 단백질이 SAM에 축적되지만, P4부터 경계면에서 그 양이 감소하는 것을 확인했습니다(보충 그림 11j). 특히, RGL3와 RGA의 발현 양상은 qmRGA에서 검출된 바와 같이 IPR에서 더 높은 GA 신호전달 활성과 일치합니다(그림 4). 더욱이, 이러한 데이터는 모든 DELLA가 SAM에서 발현되며, 이들의 발현이 전체적으로 SAM 전체에 걸쳐 나타남을 시사합니다.
다음으로 야생형 SAM(Ler, 대조군)과 gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple(global) 돌연변이체에서 세포 분열 매개변수를 분석했습니다(그림 6a, b). 흥미롭게도, 야생형과 비교하여 della global 돌연변이체 SAM에서 세포 분열 각도 빈도 분포에 통계적으로 유의미한 변화가 있음을 관찰했습니다(그림 6c). della global 돌연변이체에서의 이러한 변화는 80~90° 각도(34.71% 대 24.55%)의 빈도 증가와, 그보다 덜하지만 70~80° 각도(23.78% 대 20.18%)의 빈도 증가, 즉 가로 세포 분열에 해당하기 때문입니다(그림 6c). 비가로 분열(0~60°)의 빈도도 della global 돌연변이체에서 더 낮았습니다(그림 6c). della global 돌연변이체의 SAM에서 횡세포 분열 빈도가 유의하게 증가했습니다(그림 6b). IPR에서의 횡세포 분열 빈도 또한 야생형에 비해 della global 돌연변이체에서 더 높았습니다(그림 6d). IPR 영역 밖에서 야생형은 세포 분열 각도의 분포가 더 균일한 반면, della global 돌연변이체는 IPR과 같은 접선 방향의 분열을 선호했습니다(그림 6e). 또한 GA가 축적되는 GA 비활성 돌연변이 배경인 ga2 산화효소(ga2ox) 5중 돌연변이체(ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ga2ox6-2)의 SAM에서 세포 분열의 방향을 정량화했습니다. GA 수치의 증가와 일치하게, 5배 ga2ox 돌연변이 화서의 SAM은 Col-0보다 컸으며(보충 그림 12a, b), Col-0과 비교했을 때, 5배 ga2ox SAM은 세포 분열 각도 분포가 뚜렷하게 달랐는데, 각도 빈도가 50°에서 90°로 증가하여 접선 분열이 다시 우세했습니다(보충 그림 12a–c). 따라서, GA 신호전달의 지속적인 활성화와 GA 축적이 IPR 및 SAM의 나머지 부분에서 세포 측방 분열을 유도함을 보여줍니다.
a, b 공초점 현미경을 사용하여 PI 염색된 Ler(a) 및 글로벌 델라 돌연변이체(b) SAM의 L1 층을 3D로 시각화. 10시간 동안 SAM(원시체는 아님)에서 형성된 새로운 세포벽을 표시하고 각도 값에 따라 색상을 지정했습니다. 삽입 그림은 0시간의 SAM을 보여줍니다. 색상 막대는 오른쪽 하단 모서리에 표시되어 있습니다. (b)의 화살표는 글로벌 델라 돌연변이체에서 정렬된 세포 파일의 예를 가리킵니다. 실험은 유사한 결과로 두 번 반복되었습니다. ce Ler과 글로벌 델라 사이의 전체 SAM(d), IPR(e), 비IPR(f)에서 세포 분열 평면 방향의 빈도 분포를 비교했습니다. P 값은 양측 콜모고로프-스미르노프 검정을 사용하여 얻었습니다. f, g Col-0(i) 및 pCUC2::gai-1-VENUS(j) 형질전환 식물의 PI 염색된 SAM의 공초점 이미지의 3D 시각화. 패널 (a, b)는 10시간 이내에 SAM에서 새로운 세포벽(원기 세포벽 제외)이 형성된 것을 보여줍니다. 실험은 두 번 반복하여 유사한 결과를 얻었습니다. h–j Col-0과 pCUC2::gai-1-VENUS 식물체 사이에서 SAM 전체(h), IPR(i), 그리고 비IPR(j)에 위치한 세포 분열면 방향의 빈도 분포를 비교했습니다. P 값은 양측 콜모고로프-스미르노프 검정을 사용하여 얻었습니다.
다음으로, IPR에서 특이적으로 GA 신호 전달을 억제하는 효과를 시험했습니다. 이를 위해, VENUS에 융합된 우성 음성 gai-1 단백질(pCUC2::gai-1-VENUS 계통)의 발현을 유도하기 위해 자엽 컵 2(CUC2) 프로모터를 사용했습니다. 야생형 SAM에서, CUC2 프로모터는 P4부터 경계 세포를 포함한 SAM의 대부분의 IPR 발현을 유도했으며, pCUC2::gai-1-VENUS 식물에서도 유사한 특이적 발현이 관찰되었습니다(아래 참조). pCUC2::gai-1-VENUS 식물의 SAM 또는 IPR에 걸친 세포 분열 각도 분포는 야생형과 유의미하게 다르지 않았지만, 예상치 못하게 이러한 식물에서 IPR이 없는 세포는 80~90°의 더 높은 빈도로 분열하는 것을 발견했습니다(그림 6f–j).
세포 분열의 방향은 SAM의 기하학적 구조, 특히 조직 곡률에 의해 생성된 인장 응력에 따라 달라진다는 의견이 제시되었습니다.46 따라서 우리는 della global 돌연변이체와 pCUC2::gai-1-VENUS 식물체에서 SAM의 모양이 바뀌었는지 물었습니다. 이전에 보고된 바와 같이12, della global 돌연변이체 SAM의 크기는 야생형보다 컸습니다(보충 그림 13a, b, d). CLV3와 STM RNA의 현장 교잡은 della 돌연변이체에서 분열조직 확장을 확인했고, 줄기 세포 니치의 측면 확장을 추가로 보여주었습니다(보충 그림 13e, f, h, i). 그러나 SAM 곡률은 두 유전자형에서 유사했습니다(보충 그림 13k, m, n, p). 우리는 야생형과 비교했을 때 곡률의 변화 없이 gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple 돌연변이에서 유사한 크기 증가를 관찰했습니다(보충 그림 13c, d, g, j, l, o, p). 세포 분열 방향의 빈도도 della quadruple 돌연변이에서 영향을 받았지만 della monolithic 돌연변이보다 영향이 적었습니다(보충 그림 12d–f). 곡률에 대한 영향이 없다는 점과 함께 이러한 복용량 효과는 Della quadruple 돌연변이에서 잔류 RGL3 활성이 DELLA 활성 손실로 인한 세포 분열 방향의 변화를 제한하고 측면 세포 분열의 변화가 SAM 구조의 변화보다는 GA 신호 전달 활성의 변화에 반응하여 발생함을 시사합니다. 위에서 설명한 바와 같이, CUC2 프로모터는 P4부터 SAM에서 IPR 발현을 유도하는 반면(보충 그림 14a, b), 이와 대조적으로 pCUC2::gai-1-VENUS SAM은 크기는 작지만 곡률이 더 높았습니다(보충 그림 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM 형태의 이러한 변화는 야생형과 비교하여 기계적 응력 분포의 차이를 초래할 수 있는데, 야생형에서는 높은 원주 방향 응력이 SAM 중심에서 더 짧은 거리에서 시작됩니다47. 또는 pCUC2::gai-1-VENUS SAM 형태의 변화는 유전자 발현에 의해 유도된 국소적 기계적 특성의 변화에서 비롯될 수 있습니다48. 두 경우 모두, 이는 세포가 원주/횡방향으로 분열할 가능성을 증가시킴으로써 GA 신호 전달 변화의 영향을 부분적으로 상쇄할 수 있으며, 이는 본 연구의 관찰 결과를 설명합니다.
종합적으로, 본 연구의 데이터는 높은 GA 신호전달이 IPR에서 세포 분열 평면의 측면 방향에 중요한 역할을 한다는 것을 확인시켜 줍니다. 또한, 분열조직의 곡률 또한 IPR에서 세포 분열 평면의 방향에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.
높은 GA 신호전달 활성으로 인해 IPR에서 분열면이 횡방향으로 배열된 것은 GA가 SAM 내 표피에 방사형 세포열을 미리 형성하여 이후 표피절간에서 발견될 세포 구조를 형성함을 시사합니다. 실제로 이러한 세포열은 della global 돌연변이체의 SAM 이미지에서 자주 관찰되었습니다(그림 6b). 따라서 SAM에서 GA 신호전달의 공간적 패턴이 발달 과정에 미치는 영향을 더 자세히 알아보기 위해, 야생형(Ler 및 Col-0), della global 돌연변이체, 그리고 pCUC2::gai-1-VENUS 형질전환 식물체의 IPR 내 세포 공간 구조를 시간 경과 영상으로 분석했습니다.
우리는 qmRGA가 IPR에서 GA 신호 전달 활동이 P1/P2에서 증가하고 P4에서 정점에 도달했으며 이 패턴이 시간이 지나도 일정하게 유지되었음을 보여주었습니다(그림 4a–f 및 보충 그림 8c–f, k). GA 신호가 증가하는 IPR에서 세포의 공간적 구성을 분석하기 위해, 우리는 첫 번째 관찰 후 34시간, 즉 2배 이상의 플라스티드 시간에 분석된 발달 운명에 따라 P4 위와 옆에 Ler IPR 세포를 표시하여 P1/P2에서 P4까지 원시체 발달 동안 IPR 세포를 추적할 수 있었습니다. 우리는 세 가지 다른 색상을 사용했습니다. P4 근처의 원시체에 통합된 세포에는 노란색, IPR에 있는 세포에는 녹색, 두 가지 과정에 참여한 세포에는 보라색입니다(그림 7a–c). t0(0시간)에서 P4 앞에 1~2개의 IPR 세포 층이 보였습니다(그림 7a). 예상대로, 이 세포들은 주로 횡분열면을 통해 분열했습니다(그림 7a–c). Col-0 SAM(Ler의 P4와 유사하게 경계가 접히는 P3에 초점을 맞춤)을 사용하여 유사한 결과를 얻었지만, 이 유전자형에서는 꽃 경계에 형성된 접힘이 IPR 세포를 더 빨리 가렸습니다(그림 7g–i). 따라서 IPR 세포의 분열 패턴은 세포들을 마디 사이처럼 방사형 열로 미리 조직화합니다. 방사형 열의 조직과 연속적인 기관 사이에 IPR 세포가 위치하는 것은 이 세포들이 마디 사이의 전구 세포임을 시사합니다.
본 연구에서는 GA와 GA 수용체 농도의 결합으로 발생하는 GA 신호전달 활성을 정량적으로 측정하는 동시에 내인성 신호전달 경로의 간섭을 최소화하여 세포 수준에서 GA 기능에 대한 정보를 제공하는 비율계량적 GA 신호전달 바이오센서인 qmRGA를 개발했습니다. 이를 위해 DELLA 상호작용 파트너와의 결합 능력은 상실되었지만 GA 유도 단백질 분해에는 여전히 민감한 변형된 DELLA 단백질인 mRGA를 제작했습니다. qmRGA는 외인성 및 내인성 GA 농도 변화에 모두 반응하며, 동적 감지 특성을 통해 발생 과정 중 GA 신호전달 활성의 시공간적 변화를 평가할 수 있습니다. 또한 qmRGA는 발현에 사용되는 프로모터를 변경하여(필요한 경우) 다양한 조직에 적응시킬 수 있어 매우 유연한 도구입니다. 또한, 속씨식물 전반에 걸쳐 GA 신호전달 경로와 PFYRE 모티프가 보존되어 있어 다른 종으로의 전이가 가능할 것으로 예상됩니다.22 이와 일맥상통하게, 벼 SLR1 DELLA 단백질(HYY497AAA)의 동등한 돌연변이는 mRGA23과 유사하게 SLR1의 성장 억제자 활성을 억제하는 반면, GA 매개 분해는 미미하게 감소시키는 것으로 나타났습니다. 주목할 만한 점은 최근 애기장대 연구에서 PFYRE 도메인(S474L)의 단일 아미노산 돌연변이가 전사 인자 파트너와의 상호작용 능력에는 영향을 미치지 않으면서 RGA의 전사 활성을 변화시킨다는 것입니다.50 이 돌연변이는 mRGA에 존재하는 3가지 아미노산 치환과 매우 유사하지만, 본 연구에서는 이 두 가지 돌연변이가 DELLA의 고유한 특성을 변화시킨다는 것을 보여줍니다. 대부분의 전사 인자 파트너는 DELLA26,51의 LHR1 및 SAW 도메인에 결합하지만, PFYRE 도메인의 일부 보존 아미노산은 이러한 상호작용을 안정화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
절간 발달은 식물 구조 및 수량 증대에 중요한 형질입니다. qmRGA는 IPR 절간 전구 세포에서 더 높은 GA 신호전달 활성을 나타냈습니다. 정량적 영상과 유전학을 결합하여, GA 신호전달 패턴이 SAM 표피에서 원형/횡단 세포 분열 평면을 중첩시켜 절간 발달에 필요한 세포 분열 조직을 형성함을 보였습니다. 발달 과정에서 세포 분열 평면 방향의 여러 조절 인자가 확인되었습니다52,53. 본 연구는 GA 신호전달 활성이 이러한 세포적 매개변수를 어떻게 조절하는지에 대한 명확한 예를 제공합니다. DELLA는 사전 접힘 단백질 복합체41와 상호작용할 수 있으므로, GA 신호전달은 피질 미세소관 방향에 직접적인 영향을 미쳐 세포 분열 평면 방향을 조절할 수 있습니다40,41,54,55. 본 연구는 SAM에서 높은 GA 신호전달 활성의 상관관계가 세포 신장이나 분열이 아니라 성장 이방성임을 예상치 못하게 보여주었으며, 이는 IPR에서 GA가 세포 분열 방향에 직접적인 영향을 미친다는 것과 일치합니다. 그러나 이러한 효과가 간접적일 수도 있다는 점, 예를 들어 GA 유도 세포벽 연화56에 의해 매개될 수 있다는 점을 배제할 수 없습니다. 세포벽 특성의 변화는 기계적 스트레스를 유발하며57,58, 이는 피질 미세소관의 방향에 영향을 미쳐 세포 분열 평면의 방향에도 영향을 미칠 수 있습니다39,46,59. GA 유도 기계적 스트레스와 GA에 의한 미세소관 방향의 직접적인 조절이 복합적으로 작용하여 IPR에서 특정 세포 분열 방향 패턴을 생성하여 절간을 정의하는 데 관여할 수 있으며, 이러한 가설을 검증하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 마찬가지로, 이전 연구들은 절간 형성 조절에서 DELLA 상호작용 단백질 TCP14와 15의 중요성을 강조했습니다60,61. 이러한 요인들은 절간 발달을 조절하고 GA 신호전달에 영향을 미치는 것으로 알려진 BREVIPEDICELLUS(BP) 및 PENNYWISE(PNY)와 함께 GA의 작용을 매개할 수 있습니다2,62. DELLA가 브라시노스테로이드, 에틸렌, 자스몬산 및 아브시신산(ABA) 신호 전달 경로63,64와 상호 작용하고 이러한 호르몬이 미세소관 방향에 영향을 미칠 수 있다는 점65을 고려하면 GA가 세포 분열 방향에 미치는 영향도 다른 호르몬에 의해 매개될 수 있습니다.
초기 세포학적 연구에서는 애기장대 SAM의 내측 및 외측 영역 모두 절간 발달에 필수적임을 보여주었습니다.2,42. GA가 내측 조직에서 세포 분열을 활발하게 조절한다는 사실12은 SAM에서 분열조직과 절간 크기를 조절하는 GA의 이중 기능을 뒷받침합니다. 방향성 세포 분열 패턴 또한 내측 SAM 조직에서 엄격하게 조절되며, 이러한 조절은 줄기 성장에 필수적입니다.52. GA가 내측 SAM 조직에서 세포 분열 평면의 방향을 조절하여 SAM 내 절간의 분화 및 발달을 동기화하는 역할을 하는지 여부를 조사하는 것은 흥미로울 것입니다.
식물은 표준 조건(16시간 조명, 22°C)에서 토양 또는 1% 수크로오스와 1% 아가(Sigma)를 첨가한 1x Murashige-Skoog(MS) 배지(Duchefa)에서 시험관 내에서 재배했습니다. 단, 하배축 및 뿌리 생장 실험에서는 묘목을 수직 플레이트에서 일정한 조명과 22°C에서 재배했습니다. 질산염 실험의 경우, 적절한 질산염(0 또는 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-숙시네이트, 1% 수크로오스, 1% A-아가(Sigma)를 첨가한 변형 MS 배지(bioWORLD 식물 배지)에서 장일 조건에서 재배했습니다.
pDONR221에 삽입된 GID1a cDNA를 pDONR P4-P1R-pUBQ10 및 pDONR P2R-P3-mCherry와 재조합하여 pB7m34GW에서 pUBQ10::GID1a-mCherry를 생성했습니다. pDONR221에 삽입된 IDD2 DNA를 pB7RWG266에서 재조합하여 p35S:IDD2-RFP를 생성했습니다. pGID1b::2xmTQ2-GID1b를 생성하기 위해, GID1b 코딩 영역 상류의 3.9kb 단편과 GID1b cDNA(1.3kb)와 종료자(3.4kb)를 포함하는 4.7kb 단편을 먼저 보충 표 3의 프라이머를 사용하여 증폭한 다음, 각각 pDONR P4-P1R(Thermo Fisher Scientific)과 pDONR P2R-P3(Thermo Fisher Scientific)에 삽입하고, 마지막으로 Gateway 클로닝을 사용하여 pDONR221 2xmTQ268과 재조합하여 pGreen 012567 타겟 벡터에 넣었습니다. pCUC2::LSSmOrange를 생성하기 위해 CUC2 프로모터 서열(ATG의 상류 3229 bp)에 이어 N7 핵 국소화 신호와 NOS 전사 종결자를 갖는 대형 Stokes-shifted mOrange(LSSmOrange)69의 코딩 서열을 Gateway 3-fragment recombination system(Invitrogen)을 사용하여 pGreen 카나마이신 표적 벡터에 조립했습니다. 식물 이진 벡터는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101에 도입하고 Agrobacterium 침투법으로 Nicotiana benthamiana 잎에, 꽃 침지법으로 Arabidopsis thaliana Col-0에 각각 도입했습니다. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry와 pCLV3::mCherry-NLS qmRGA는 각각 해당 교배의 F3 및 F1 자손에서 분리했습니다.
약 1cm 길이의 싹 끝부분(shoot tip)에 RNA in situ 하이브리다이제이션을 수행하였고,72 채취 후 4°C로 예냉한 FAA 용액(3.7% 포름알데히드, 5% 아세트산, 50% 에탄올)에 즉시 고정하였다. 15분씩 2회 진공 처리 후, 고정액을 교체하고 샘플을 하룻밤 동안 배양하였다. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, RGL3 cDNA와 이들의 3'-UTR에 대한 안티센스 프로브는 Rosier 등이 기술한 바와 같이 보충 표 3에 제시된 프라이머를 사용하여 합성하였다.73 디곡시제닌 표지 프로브는 디곡시제닌 항체(3000배 희석; Roche, 카탈로그 번호: 11 093 274 910)를 사용하여 면역 검출되었고, 절편은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염(BCIP, 250배 희석)/니트로블루 테트라졸륨(NBT, 200배 희석) 용액으로 염색되었습니다.
게시 시간: 2025년 2월 10일