본 연구는 상업용 제품의 치사율, 아치사율 및 독성을 평가했습니다.사이퍼메트린양서류 올챙이에 대한 시판 시페르메트린 제제의 효과를 평가했습니다. 급성 시험에서는 100~800 μg/L 농도로 96시간 동안 처리했습니다. 만성 시험에서는 자연 발생 시페르메트린 농도(1, 3, 6, 20 μg/L)에서 사망률을 측정하고, 이어서 소핵 검사 및 적혈구 핵 이상을 7일 동안 관찰했습니다. 시판 시페르메트린 제제의 올챙이에 대한 LC50은 273.41 μg L⁻¹였습니다. 만성 시험에서 가장 높은 농도(20 μg L⁻¹)에서는 시험 대상 올챙이의 절반이 죽어 50% 이상의 사망률을 보였습니다. 소핵 검사에서는 6 μg L⁻¹와 20 μg L⁻¹ 농도에서 유의미한 결과가 나타났고, 여러 핵 이상이 관찰되어 시판 시페르메트린 제제가 P. gracilis에 대해 유전독성 가능성을 가지고 있음을 시사합니다. 사이퍼메트린은 이 종에게 높은 위험성을 지니고 있으며, 단기 및 장기적으로 다양한 문제를 야기하고 생태계의 역동성에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 따라서 시판되는 사이퍼메트린 제제는 P. gracilis에 독성 영향을 미친다고 결론지을 수 있습니다.
농업 활동의 지속적인 확대와 집약적인 적용으로 인해해충 방제방제 조치로 인해 수생 동물은 살충제에 자주 노출됩니다.1,2 농경지 인근 수자원의 오염은 양서류와 같은 비표적 생물의 발달과 생존에 영향을 미칠 수 있습니다.
양서류는 환경 매트릭스 평가에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 개구리류는 복잡한 생활 주기, 빠른 유생 성장 속도, 영양 상태, 투과성 피부10,11, 번식을 위한 물 의존성12, 보호되지 않은 알11,13,14과 같은 독특한 특성 때문에 환경 오염 물질의 좋은 생물지표로 여겨집니다. 흔히 울음개구리로 알려진 작은물개구리(Physalaemus gracilis)는 살충제 오염의 생물지표종으로 밝혀졌습니다4,5,6,7,15. 이 종은 아르헨티나, 우루과이, 파라과이, 브라질의 고인 물, 보호 구역 또는 다양한 서식지에서 발견되며16,17, 넓은 분포와 다양한 서식지에 대한 내성 때문에 IUCN 분류에서 안정적인 종으로 간주됩니다18.
양서류에서 사이퍼메트린 노출 후 나타나는 아치사 효과로는 올챙이의 행동, 형태 및 생화학적 변화23,24,25, 사망률 및 변태 시간 변화, 효소 변화, 부화 성공률 감소24,25, 과잉행동26, 콜린에스테라제 활성 억제27 및 수영 능력 변화7,28 등이 보고되었습니다. 그러나 양서류에서 사이퍼메트린의 유전독성 효과에 대한 연구는 제한적입니다. 따라서 개구리목 종의 사이퍼메트린 감수성을 평가하는 것이 중요합니다.
환경 오염은 양서류의 정상적인 성장과 발달에 영향을 미치지만, 가장 심각한 악영향은 살충제 노출로 인한 DNA 손상입니다.13 혈구 형태 분석은 오염 및 야생종에 대한 물질의 잠재적 독성을 나타내는 중요한 생물지표입니다.29 소핵 검사는 환경 내 화학물질의 유전독성을 측정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다.30 이 검사는 신속하고 효과적이며 저렴한 방법으로, 양서류와 같은 생물체의 화학 오염을 잘 나타내는 지표이며,31,32 유전독성 오염물질 노출에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.33
본 연구의 목적은 소핵 검사 및 생태학적 위험 평가를 이용하여 시판되는 사이퍼메트린 제제의 어린 수생 올챙이에 대한 독성 가능성을 평가하는 것이었다.
시험의 급성기 동안 다양한 농도의 상업용 사이퍼메트린에 노출된 P. gracilis 올챙이의 누적 사망률(%).
만성 시험 동안 다양한 농도의 상업용 사이퍼메트린에 노출된 P. gracilis 올챙이의 누적 사망률(%).
관찰된 높은 사망률은 다양한 농도의 사이퍼메트린(6 및 20 μg/L)에 노출된 양서류에서 나타난 유전독성 효과의 결과였으며, 이는 적혈구의 미세핵(MN) 및 핵 이상으로 입증되었습니다. 미세핵 형성은 유사분열 오류를 나타내며, 염색체와 미세소관의 결합 불량, 염색체 흡수 및 운반을 담당하는 단백질 복합체의 결함, 염색체 분리 오류 및 DNA 손상 복구 오류38,39와 관련이 있으며, 살충제 유발 산화 스트레스40,41와도 연관될 수 있습니다. 다른 이상 소견들도 모든 평가 농도에서 관찰되었습니다. 사이퍼메트린 농도가 증가함에 따라 적혈구의 핵 이상은 가장 낮은 농도(1 μg/L)에서 5%, 가장 높은 농도(20 μg/L)에서 20% 증가했습니다. 예를 들어, 종의 DNA 변화는 단기 및 장기 생존 모두에 심각한 결과를 초래하여 개체군 감소, 생식 적합성 변화, 근친교배, 유전적 다양성 손실, 이주율 변화 등을 야기할 수 있습니다. 이러한 모든 요인은 종의 생존과 유지에 영향을 미칠 수 있습니다.42,43 적혈구 이상은 세포질 분열 차단으로 인해 비정상적인 세포 분열(이핵 적혈구)이 나타나는 것을 의미할 수 있습니다.44,45 다엽핵은 핵막이 여러 개의 엽으로 돌출된 형태입니다.46 또한, 핵신장/핵소포와 같은 다른 적혈구 이상은 DNA 증폭과 관련될 수 있습니다.47 무핵 적혈구는 특히 오염된 물에서 산소 운반 장애를 나타낼 수 있습니다.48,49 세포사멸은 세포 사멸을 의미합니다.50
다른 연구에서도 사이퍼메트린의 유전독성 효과가 입증되었습니다. Kabaña 등51은 Odontophrynus americanus 세포를 고농도의 사이퍼메트린(5000 및 10000 μg L−1)에 96시간 노출시킨 후 미세핵과 이핵 세포, 세포자멸사 세포와 같은 핵 변화가 나타나는 것을 확인했습니다. 사이퍼메트린에 의한 세포자멸사는 P. biligonigerus52 및 Rhinella arenarum53에서도 관찰되었습니다. 이러한 결과는 사이퍼메트린이 다양한 수생 생물에 유전독성 효과를 나타내며, MN 및 ENA 분석법이 양서류에 대한 아치사 효과를 나타내는 지표가 될 수 있고, 독성 물질에 노출된 토착종 및 야생 개체군에 적용될 수 있음을 시사합니다12.
시판되는 사이퍼메트린 제제는 미국 환경보호청(EPA) 기준치54를 초과하는 높은 HQ 값을 나타내어 환경에 존재할 경우 해당 종에 악영향을 미칠 수 있는 심각한 환경 위험(급성 및 만성 모두)을 초래합니다. 만성 위험 평가에서 사망률에 대한 무영향관찰농도(NOEC)는 3 μg L−1로 나타나, 수중에서 발견되는 농도가 해당 종에 위험을 초래할 수 있음을 확인했습니다55. 엔도설판과 사이퍼메트린 혼합물에 노출된 R. arenarum 유충의 치사 NOEC는 168시간 후 500 μg L−1였으며, 이 값은 336시간 후 0.0005 μg L−1로 감소했습니다. 연구진은 노출 시간이 길수록 해당 종에 유해한 농도가 낮아진다는 것을 보여줍니다. 또한, 동일한 노출 시간에서 P. gracilis의 NOEC 값보다 R. arenarum의 NOEC 값이 더 높다는 점은 사이퍼메트린에 대한 종 특이적 반응을 시사합니다. 더욱이, 사망률 측면에서 사이퍼메트린에 노출된 P. gracilis의 CHQ 값은 64.67에 달했는데, 이는 미국 환경보호청(EPA)에서 설정한 기준값54보다 높은 수치이며, R. arenarum 유충의 CHQ 값 또한 이 기준값(336시간 후 CHQ > 388.00)보다 높아 연구 대상 살충제가 여러 양서류 종에 높은 위험을 초래할 수 있음을 시사합니다. P. gracilis의 변태 완료에 약 30일이 소요된다는 점을 고려할 때56, 연구 대상 농도의 사이퍼메트린은 감염된 개체가 어린 나이에 성체 또는 번식 단계로 진입하는 것을 막아 개체 수 감소에 기여할 수 있다고 결론지을 수 있습니다.
미세핵 및 기타 적혈구 핵 이상에 대한 위험 평가에서 CHQ 값은 14.92에서 97.00 범위에 있었으며, 이는 사이퍼메트린이 자연 서식지에서도 P. gracilis에 잠재적인 유전독성 위험을 초래할 수 있음을 나타냅니다. 사망률을 고려했을 때, P. gracilis가 견딜 수 있는 외래 화합물의 최대 농도는 4.24 μg L−1였습니다. 그러나 1 μg/L의 낮은 농도에서도 유전독성 효과가 나타났습니다. 이러한 사실은 기형 개체 수의 증가57로 이어지고 서식지에서 종의 발달과 번식에 영향을 미쳐 양서류 개체 수 감소를 초래할 수 있습니다.
상업용 살충제 시페르메트린 제제는 P. gracilis에 대해 높은 급성 및 만성 독성을 나타냈다. 높은 사망률이 관찰되었는데, 이는 독성 효과 때문인 것으로 추정되며, 특히 미세핵, 적혈구 핵 이상, 특히 톱니 모양 핵, 엽상 핵, 소포성 핵의 존재가 이를 뒷받침한다. 또한, 연구 대상 종은 급성 및 만성적으로 환경 위험이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 우리 연구팀의 이전 연구 결과와 함께, 다양한 상업용 시페르메트린 제제조차도 P. gracilis에서 아세틸콜린에스테라제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라제(BChE) 활성 감소와 산화 스트레스를 유발하고, 유영 활동 변화 및 구강 기형을 초래한다는 것을 보여준다.58,59 이는 상업용 시페르메트린 제제가 이 종에 대해 높은 치사 및 아치사 독성을 가지고 있음을 시사한다. (Hartmann et al.) 60번 연구에서는 시판되는 사이퍼메트린 제제가 다른 9가지 살충제에 비해 P. gracilis와 같은 속의 다른 종(P. cuvieri)에 가장 독성이 강한 것으로 나타났습니다. 이는 환경 보호를 위해 법적으로 승인된 농도의 사이퍼메트린이 높은 사망률과 장기적인 개체수 감소를 초래할 수 있음을 시사합니다.
환경에서 검출된 농도가 양서류의 높은 사망률을 유발하고 특히 P. gracilis 종에 잠재적인 위험을 초래할 수 있으므로, 양서류에 대한 살충제의 독성을 평가하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 양서류, 특히 브라질 종에 대한 자료가 부족하기 때문에 양서류 종에 대한 연구를 장려해야 합니다.
만성 독성 시험은 정지 상태에서 168시간(7일) 동안 진행되었으며, 아치사 농도는 1, 3, 6, 20 μg ai L⁻¹였다. 두 실험 모두 각 처리군당 10마리의 올챙이를 사용하여 6회 반복 실험을 수행하여, 각 농도당 총 60마리의 올챙이를 사용하였다. 한편, 물만 투여한 처리군은 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험 장치는 500ml 용량의 멸균 유리 접시에 용액 50ml당 올챙이 1마리를 넣어 구성하였다. 플라스크는 증발을 방지하기 위해 폴리에틸렌 필름으로 덮고 지속적으로 공기를 공급하였다.
물 시료는 0시간, 96시간, 168시간 간격으로 화학 분석을 통해 살충제 농도를 측정했습니다. Sabin 등68 및 Martins 등69에 따르면, 분석은 산타마리아 연방대학교 살충제 분석 연구실(LARP)에서 가스 크로마토그래피와 삼중 사중극자 질량 분석기(Varian 모델 1200, Palo Alto, California, USA)를 결합하여 수행했습니다. 물 속 살충제의 정량 분석 결과는 부록(표 SM1)에 제시되어 있습니다.
소핵 검사(MNT)와 적혈구 핵 이상 검사(RNA)를 위해 각 처리군에서 올챙이 15마리를 분석했습니다. 올챙이에게 5% 리도카인(50mg/g)을 투여하여 마취시킨 후, 일회용 헤파린 처리 주사기를 사용하여 심장 천자를 통해 혈액을 채취했습니다. 멸균 현미경 슬라이드에 혈액 도말 표본을 제작하고 공기 중에서 건조시킨 후, 100% 메탄올(4°C)에 2분간 고정하고, 10% 김자 용액으로 암실에서 15분간 염색했습니다. 염색이 끝난 후, 슬라이드를 증류수로 세척하여 과도한 염색액을 제거하고 실온에서 건조시켰습니다.
각 올챙이에서 최소 1000개의 적혈구를 100배율 현미경과 71배율 대물렌즈를 사용하여 분석하여 MN과 ENA의 존재 여부를 확인했습니다. 사이퍼메트린 농도와 대조군을 고려하여 총 75,796개의 올챙이 적혈구를 평가했습니다. 유전독성은 Carrasco et al. 및 Fenech et al.38,72의 방법에 따라 다음과 같은 핵 병변의 빈도를 측정하여 분석했습니다. (1) 무핵 세포: 핵이 없는 세포; (2) 세포사멸 세포: 핵 파편화, 프로그램된 세포사멸; (3) 이핵 세포: 핵이 두 개인 세포; (4) 핵 돌출 또는 소포 세포: 핵막이 작게 돌출된 핵을 가진 세포, 소핵과 크기가 비슷한 소포; (5) 핵용해 세포: 핵의 윤곽만 있고 내부 물질이 없는 세포. (6) 홈이 파인 세포: 핵의 모양에 뚜렷한 균열이나 홈이 있는 세포, 즉 신장 모양 핵이라고도 함; (7) 엽상 세포: 앞서 언급한 소포보다 핵 돌출부가 더 큰 세포; 및 (8) 미세 세포: 핵이 응축되고 세포질이 감소된 세포. 이러한 변화는 음성 대조군 결과와 비교되었습니다.
급성 독성 시험 결과(LC50)는 GBasic 소프트웨어와 TSK-Trimmed Spearman-Karber 방법74을 사용하여 분석했습니다. 만성 시험 데이터는 오차의 정규성(Shapiro-Wilks)과 분산의 동질성(Bartlett)을 사전 검사했습니다. 결과는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석했습니다. 데이터 간의 비교에는 Tukey 검정을, 치료군과 음성 대조군 간의 비교에는 Dunnett 검정을 사용했습니다.
LOEC 및 NOEC 데이터는 Dunnett 검정을 사용하여 분석했습니다. 통계 분석은 Statistica 8.0 소프트웨어(StatSoft)를 사용하여 유의수준 95%(p < 0.05)에서 수행했습니다.
게시 시간: 2025년 3월 13일