식물 및 병원체 물질
수수 전환 인구(SCP)로 알려진 수수 협회 매핑 인구는 일리노이 대학(현재 UC Davis)의 Pat Brown 박사가 제공했습니다.이는 이전에 설명되었으며 미국 환경에서 식물의 성장과 발달을 촉진하기 위해 광주기 무감각 및 더 작은 키로 변환된 다양한 계통의 모음입니다.본 연구에서는 이 모집단의 510개 계통을 사용했지만 발아 불량 및 기타 품질 관리 문제로 인해 세 가지 형질 분석에 모든 계통이 사용되지는 않았습니다.궁극적으로 345개 계통의 데이터가 키틴 반응 분석에 사용되었고, 472개 계통은 flg22 반응에, 456개 계통은 TLS 저항성 분석에 사용되었습니다.B. 쿠케이LSLP18 균주는 아칸소 대학교의 Burt Bluhm 박사로부터 입수했습니다.
MAMP 반응 측정
이 연구에서는 flg22(Genscript 카탈로그 번호 RP19986)와 키틴의 두 가지 다른 MAMP가 사용되었습니다.수수 식물은 온실 내 토양(33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix)으로 채워진 평지에 놓인 삽입물에서 재배되었습니다.수집 당일 잎의 과도한 수분을 방지하기 위해 샘플 수집 전날 식물에 물을 공급했습니다.
계통은 무작위로 선정되었으며 물류상의 이유로 60개 계통으로 배치되었습니다.각 줄마다 3개의 '화분'에 줄당 2개의 종자를 심었습니다.전체 개체군이 평가될 때까지 이전 배치가 처리되자마자 후속 배치를 심었습니다.두 번의 실행 각각에서 유전자형이 다시 무작위화되어 두 MAMP에 대해 두 번의 실험 실행이 수행되었습니다.
ROS 분석은 이전에 설명한대로 수행되었습니다.간단히 말하면, 각 라인마다 6개의 씨앗을 3개의 다른 화분에 심었습니다.결과 묘목 중에서 균일성을 기준으로 3개를 선택했습니다.특이해 보이거나 대다수보다 상당히 크거나 짧은 묘목은 사용되지 않았습니다.3mm 직경의 4개의 잎 원반을 15일 된 서로 다른 3개의 수수 식물의 4번째 잎의 가장 넓은 부분에서 잘라냈습니다.두 식물의 잎당 하나의 디스크와 한 식물의 두 개의 디스크, 두 번째 디스크는 물 조절 장치가 됩니다(아래 참조).디스크를 검정색 96웰 플레이트의 H2O 50μl 위에 개별적으로 부유시키고, 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 씰로 밀봉하고 밤새 실온에서 보관했습니다.다음날 아침 2mg/ml 화학발광 프로브 L-012(Wako, 카탈로그 번호 120-04891), 2mg/ml 양고추냉이 퍼옥시다제(유형 VI-A, Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 P6782)를 사용하여 반응 용액을 만들었습니다. 100mg/ml 키틴 또는 Flg22 2μM.이 반응 용액 50μl를 4개 웰 중 3개 웰에 첨가했습니다.네 번째 웰은 MAMP를 제외한 반응액을 첨가한 모의 대조군(mock control)이었다.물만 들어 있는 4개의 빈 웰도 각 플레이트에 포함되었습니다.
반응액을 첨가한 후 SynergyTM 2 다중검출 마이크로플레이트 리더(BioTek)를 이용하여 2분 간격으로 1시간 동안 발광도를 측정하였다.플레이트 판독기는 이 1시간 동안 2분마다 발광 측정을 수행합니다.31개 판독값의 합계를 계산하여 각 웰의 값을 제공했습니다.각 유전자형에 대한 MAMP 반응의 추정값은 (3개의 실험 웰의 평균 발광 값 - 모의 웰 값) - 평균 블랭크 웰 값을 뺀 값으로 계산되었습니다.블랭크 웰 값은 지속적으로 0에 가까웠습니다.
잎 디스크니코티아나 벤타미아나, 하나의 고반응 수수 계통(SC0003) 및 하나의 저반응 수수 계통(PI 6069)도 품질 관리 목적을 위해 각 96웰 플레이트에 대조군으로 포함되었습니다.
B. 쿠케이접종원 준비 및 접종
B. 쿠케이접종원은 이전에 설명한 대로 준비되었습니다.간단히 말하면, 수수 곡물을 3일 동안 물에 담근 후 헹구고 1L 원뿔형 플라스크에 퍼낸 후 15psi 및 121°C에서 1시간 동안 고압멸균했습니다.그런 다음 곡물에 신선한 배양균에서 나온 침연된 균사체 약 5ml를 접종했습니다.B. 쿠케이LSLP18을 분리하고 실온에서 2주 동안 방치하면서 3일마다 플라스크를 흔들었습니다.2주 후, 곰팡이가 감염된 수수를 공기 건조시킨 후 포장 접종까지 4°C에서 보관했습니다.전체 실험에 동일한 접종원이 사용되었으며 매년 새로 만들어졌습니다.접종을 위해 6~10개의 감염된 곡물을 4~5주된 수수 식물의 소용돌이에 넣었습니다.이 곰팡이에서 생성된 포자는 일주일 이내에 어린 수수 식물에 감염을 시작했습니다.
종자 준비
밭에 심기 전에 수수 종자를 약 1% Spirato 480 FS 살균제, 4% Sebring 480 FS 살균제, 3% Sorpro 940 ES 종자 완화제를 함유하는 살균제, 살충제 및 완화제 혼합물로 처리했습니다.그런 다음 씨앗을 3일 동안 공기 건조시켜 씨앗 주위에 이 혼합물을 얇게 코팅했습니다.세이너는 출현 전 치료법으로 제초제 듀얼 매그넘(Dual Magnum)의 사용을 허용했습니다.
표적 잎 반점 저항성 평가
SCP는 2017년 6월 14~15일과 2018년 6월 20일에 노스캐롤라이나주 클레이턴에 있는 중앙 작물 연구소에 각 경우에 두 번의 실험적 복제가 포함된 무작위 완전 블록 설계로 심었습니다.실험은 플롯당 10개의 종자를 사용하여 0.9m 행 너비로 1.8m 단일 행에 심었습니다.가장자리 효과를 방지하기 위해 각 실험의 주변에 두 개의 경계선을 심었습니다.실험은 2017년 7월 20일과 2018년 7월 20일에 접종되었으며 이 시점에서 수수 식물은 성장 단계 3에 있었습니다. 등급은 1~9 등급으로 이루어졌으며, 여기서 질병의 징후가 전혀 없는 식물은 9점으로 점수가 매겨졌습니다. 죽은 식물은 1로 기록되었습니다.매년 접종 후 2주 후에 시작하여 2017년에 2개의 평가가 이루어졌고 2018년에는 4개의 판독값이 채취되었습니다.sAUDPC(질병 진행 곡선 아래 표준화된 영역)는 이전에 설명한 대로 계산되었습니다.
게시 시간: 2021년 4월 1일