식물 및 병원체 물질
일리노이 대학교(현 UC 데이비스)의 팻 브라운 박사는 수수 전환 개체군(SCP)으로 알려진 수수 연관 지도 작성 개체군을 제공했습니다. 이 개체군은 이전에 보고된 바 있으며, 미국 환경에서 식물의 생육과 발달을 촉진하기 위해 광주기 불감성 및 소형으로 전환된 다양한 계통들의 집합입니다. 이 연구에서는 이 개체군에서 510개 계통을 사용했지만, 발아 불량 및 기타 품질 관리 문제로 인해 세 가지 형질 모두 분석에 모든 계통을 사용하지는 못했습니다. 최종적으로 345개 계통의 데이터는 키틴 반응 분석에, 472개 계통은 flg22 반응 분석에, 456개 계통은 TLS 저항성 분석에 사용되었습니다.B. 쿠케이LSLP18 균주는 아칸소 대학의 Burt Bluhm 박사로부터 얻었습니다.
MAMP 반응 측정
본 연구에서는 두 가지 다른 MAMP(flg22, Genscript 카탈로그 번호 RP19986)와 키틴을 사용했습니다. 수수는 온실에서 토양(Sunshine Redi-Earth Pro 재배 혼합물 33%)이 채워진 평평한 곳에 심은 인서트에서 재배했습니다. 채취 당일 잎에 과도한 수분이 축적되는 것을 방지하기 위해 시료 채취 전날 물을 주었습니다.
각 계통은 무작위로 선정되었고, 물류상의 이유로 60개 계통씩 배치로 심었습니다. 각 계통마다 세 개의 '화분'에 각 계통당 두 개의 씨앗을 심었습니다. 이전 배치의 처리가 완료되는 대로, 전체 집단을 평가할 때까지 다음 배치를 심었습니다. 두 MAMP에 대해 두 번의 실험을 수행했으며, 두 번의 실험에서 유전자형을 각각 재정렬했습니다.
ROS 분석은 이전에 설명한 대로 수행했습니다. 간략하게 설명하면, 각 계통마다 6개의 씨앗을 3개의 다른 화분에 심었습니다. 그 결과 나온 묘목 중 균일성을 기준으로 3개를 선택했습니다. 특이하게 보이거나 대부분보다 키가 크거나 작은 묘목은 사용하지 않았습니다. 15일 된 수수 3개에서 4번째 잎의 가장 넓은 부분에서 직경 3mm의 잎 디스크 4개를 잘라냈습니다. 두 식물에서 잎당 디스크 1개, 한 식물에서 디스크 2개를 사용했으며, 두 번째 디스크는 수분 대조군으로 사용했습니다(아래 참조). 디스크를 각각 검은색 96-웰 플레이트의 50 µl H₂O에 띄운 후, 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 씰로 밀봉하고 실온에서 하룻밤 동안 보관했습니다. 다음 날 아침, 2 mg/ml의 화학발광 프로브 L-012(Wako, 카탈로그 번호 120-04891), 2 mg/ml의 양고추냉이 과산화효소(Type VI-A, Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 P6782), 그리고 100 mg/ml의 키틴 또는 2 μM의 Flg22를 사용하여 반응 용액을 제조했습니다. 이 반응 용액 50 µl를 네 개의 웰 중 세 개에 첨가했습니다. 네 번째 웰은 MAMP를 제외한 반응 용액을 첨가한 모의 대조군으로 사용했습니다. 각 플레이트에는 물만 포함된 네 개의 빈 웰도 포함했습니다.
반응 용액을 첨가한 후, SynergyTM 2 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 1시간 동안 2분 간격으로 발광을 측정했습니다. 플레이트 판독기는 이 1시간 동안 2분마다 발광을 측정했습니다. 31개 판독값의 합을 계산하여 각 웰의 값을 구했습니다. 각 유전자형에 대한 MAMP 반응의 추정값은 (세 실험 웰의 평균 발광값 - 모의 웰 값)에서 평균 블랭크 웰 값을 뺀 값으로 계산했습니다. 블랭크 웰 값은 항상 0에 가까웠습니다.
잎 디스크니코티아나 벤타미아나각 96웰 플레이트에는 반응성이 높은 수수 품종(SC0003) 하나와 반응성이 낮은 수수 품종(PI 6069) 하나가 품질 관리를 위한 대조군으로 포함되었습니다.
B. 쿠케이접종제 준비 및 접종
B. 쿠케이접종원은 이전에 설명한 대로 준비했습니다. 간단히 설명하면, 수수 알갱이를 3일 동안 물에 담가 두었다가 헹군 후 1L 삼각 플라스크에 옮겨 담고 15psi, 121°C에서 한 시간 동안 고압멸균했습니다. 그런 다음, 신선한 수수 배양액에서 추출한 약 5ml의 균사체를 수수 알갱이에 접종했습니다.B. 쿠케이LSLP18 분리균을 분리하고 2주 동안 실온에서 방치하면서 3일마다 플라스크를 흔들어 주었다. 2주 후, 곰팡이에 감염된 수수 알갱이를 공기 건조시킨 후 현장 접종 전까지 4°C에 보관했다. 전체 실험 기간 동안 동일한 접종원을 사용했으며 매년 새로 접종했다. 접종을 위해 4~5주 된 수수 묘목에 감염된 알갱이 6~10개를 넣었다. 이 곰팡이에서 생성된 포자는 어린 수수 묘목에서 일주일 이내에 감염을 시작했다.
종자 준비
밭에 파종하기 전, 수수 종자를 Spirato 480 FS 살균제 약 1%, Sebring 480 FS 살균제 4%, Sorpro 940 ES 종자 안전제 3%를 혼합한 살균제, 살충제, 그리고 안전제 혼합물로 처리했습니다. 그런 다음 종자를 3일 동안 자연 건조하여 이 혼합물이 종자 주위에 얇게 코팅되도록 했습니다. 안전제 덕분에 듀얼 매그넘 제초제를 발아 전 처리제로 사용할 수 있었습니다.
타깃 잎점병 저항성 평가
SCP는 2017년 6월 14-15일과 2018년 6월 20일에 노스캐롤라이나주 클레이튼에 있는 중앙작물연구소에 각각 2회 실험 반복을 하는 무작위 완전 블록 설계로 심었습니다. 실험은 플롯당 10개의 씨앗을 사용하여 0.9m 행 너비의 1.8m 단일 행으로 심었습니다. 각 실험의 주변에 두 개의 경계 행을 심어 가장자리 효과를 방지했습니다. 실험은 2017년 7월 20일과 2018년 7월 20일에 접종했으며 이 시점에서 수수 식물은 성장 단계 3에 있었습니다. 평가는 1~9점 척도로 진행했으며, 질병 징후가 없는 식물은 9점, 완전히 죽은 식물은 1점으로 평가했습니다. 2017년에는 2회 평가를 받았고, 2018년에는 매년 접종 2주 후에 시작하여 4회 판독했습니다. sAUDPC(질병 진행 곡선 아래의 표준화된 면적)는 이전에 설명한 대로 계산했습니다.
게시 시간: 2021년 4월 1일