식물 및 병원균 물질
수수 전환 집단(SCP)으로 알려진 수수 연관 매핑 집단은 일리노이 대학교(현재 UC 데이비스)의 팻 브라운 박사로부터 제공받았습니다. 이 집단은 이전에 설명된 바 있으며, 미국 환경에서 식물의 생장과 발달을 용이하게 하기 위해 광주기 불감성 및 소형화를 갖도록 전환된 다양한 계통들의 집합체입니다. 본 연구에서는 이 집단의 510개 계통을 사용했지만, 발아율 저하 및 기타 품질 관리 문제로 인해 모든 계통을 세 가지 형질 분석에 모두 사용하지는 못했습니다. 최종적으로 키틴 반응 분석에는 345개 계통, flg22 반응 분석에는 472개 계통, TLS 저항성 분석에는 456개 계통의 데이터를 사용했습니다.B. 쿠케이LSLP18 균주는 아칸소 대학교의 버트 블루흠 박사로부터 얻었습니다.
MAMP 반응 측정
본 연구에서는 flg22(Genscript 카탈로그 번호 RP19986)와 키틴, 두 가지 MAMP를 사용했습니다. 수수 식물은 온실에서 토양(Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix 33%)으로 채워진 트레이 위에 놓인 인서트에서 재배했습니다. 시료 채취 당일 잎에 과도한 수분이 있는 것을 방지하기 위해 채취 전날 식물에 물을 주었습니다.
계통들은 무작위로 배열되었고, 물류상의 이유로 60개 계통씩 묶어서 파종했습니다. 각 계통마다 3개의 화분에 계통당 2개의 씨앗을 심었습니다. 이전 배치의 처리가 완료되는 대로 다음 배치를 파종하는 방식으로 전체 개체군을 조사했습니다. 두 가지 MAMP 모두에 대해 두 번의 실험을 수행했으며, 각 실험마다 유전자형을 다시 무작위로 배열했습니다.
ROS 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. 간단히 설명하면, 각 계통에 대해 6개의 종자를 3개의 다른 화분에 심었습니다. 그 결과 생성된 묘목 중에서 균일성을 기준으로 3개를 선택했습니다. 모양이 비정상적이거나 대다수보다 키가 현저히 크거나 작은 묘목은 사용하지 않았습니다. 15일 된 수수 식물 3개의 4번째 잎의 가장 넓은 부분에서 직경 3mm의 잎 디스크 4개를 잘라냈습니다. 두 식물에서는 잎당 디스크 1개씩, 한 식물에서는 디스크 2개를 사용했으며, 두 번째 디스크는 물 대조군으로 사용했습니다(아래 참조). 디스크는 각각 검은색 96웰 플레이트에 담긴 50µl의 물에 띄우고, 빛 노출을 피하기 위해 알루미늄 씰로 밀봉한 후 실온에서 하룻밤 동안 보관했습니다. 다음 날 아침, 2 mg/ml 농도의 화학발광 프로브 L-012(Wako, 카탈로그 번호 120-04891), 2 mg/ml 농도의 서양고추냉이 과산화효소(Type VI-A, Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 P6782), 그리고 100 mg/ml 농도의 키틴 또는 2 μM 농도의 Flg22를 사용하여 반응 용액을 제조했습니다. 이 반응 용액 50 μl를 4개의 웰 중 3개에 첨가했습니다. 나머지 한 웰은 대조군으로, MAMP를 제외한 반응 용액만 첨가했습니다. 또한, 각 플레이트에는 물만 포함된 빈 웰 4개를 추가했습니다.
반응 용액을 첨가한 후, SynergyTM 2 다중 검출 마이크로플레이트 리더(BioTek)를 사용하여 1시간 동안 2분 간격으로 발광을 측정했습니다. 플레이트 리더는 이 1시간 동안 2분 간격으로 발광을 측정합니다. 총 31개의 측정값을 합산하여 각 웰의 값을 구했습니다. 각 유전자형에 대한 MAMP 반응의 추정값은 (세 실험 웰의 평균 발광값 - 대조군 웰 값) - 대조군 웰의 평균 발광값으로 계산했습니다. 대조군 웰의 값은 일관되게 0에 가까웠습니다.
잎 디스크니코티아나 벤타미아나품질 관리 목적으로 반응성이 높은 수수 품종(SC0003) 하나와 반응성이 낮은 수수 품종(PI 6069) 하나를 각 96웰 플레이트에 대조군으로 포함시켰습니다.
B. 쿠케이접종원 준비 및 접종
B. 쿠케이접종원은 앞서 설명한 대로 준비했습니다. 간단히 설명하면, 수수 알갱이를 3일 동안 물에 담근 후 헹궈서 1L 삼각 플라스크에 담고 15psi의 압력과 121°C의 온도에서 1시간 동안 고압멸균했습니다. 그런 다음 신선한 배양액에서 얻은 분쇄된 균사체 약 5ml를 알갱이에 접종했습니다.B. 쿠케이LSLP18 균주를 분리하여 실온에서 2주 동안 배양하고, 3일에 한 번씩 플라스크를 흔들어 주었다. 2주 후, 곰팡이에 감염된 수수 알갱이를 공기 건조시킨 후 포장 접종 전까지 4°C에서 보관했다. 동일한 접종원을 전체 실험 기간 동안 사용했으며, 매년 새로 제조했다. 접종을 위해 감염된 알갱이 6~10개를 4~5주 된 수수 식물의 잎집에 넣었다. 이 곰팡이에서 생성된 포자는 일주일 이내에 어린 수수 식물에 감염을 일으켰다.
종자 준비
파종 전 수수 종자는 살균제, 살충제 및 종자 보호제 혼합물(스피라토 480 FS 살균제 약 1%, 세브링 480 FS 살균제 4%, 소르프로 940 ES 종자 보호제 3%)로 처리했습니다. 그런 다음 종자를 3일 동안 자연 건조하여 종자 표면에 이 혼합물이 얇게 코팅되도록 했습니다. 이 종자 보호제 덕분에 발아 전 제초제인 듀얼 매그넘을 사용할 수 있었습니다.
표적잎반점병 저항성 평가
SCP는 2017년 6월 14~15일과 2018년 6월 20일에 노스캐롤라이나주 클레이턴에 있는 중앙 작물 연구소(Central Crops Research Station)에 무작위 완전 블록 설계로 파종되었으며, 각 실험에는 2개의 반복이 포함되었습니다. 실험은 1.8m 길이의 단일 열에 0.9m 너비로 플롯당 10개의 종자를 사용하여 파종했습니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 각 실험의 주변에 두 줄의 경계 열을 심었습니다. 접종은 2017년 7월 20일과 2018년 7월 20일에 실시되었으며, 이때 수수 식물은 생장 3단계였습니다. 평가는 1에서 9까지의 척도로 이루어졌으며, 질병 징후가 없는 식물은 9점, 완전히 죽은 식물은 1점으로 평가했습니다. 2017년에는 접종 후 2주부터 매년 2회, 2018년에는 4회 평가를 실시했습니다. sAUDPC(표준화된 질병 진행 곡선 아래 면적)는 이전에 설명된 방법으로 계산했습니다.
게시 시간: 2021년 4월 1일