소나무 선충류는 소나무 숲 생태계에 심각한 경제적 손실을 초래하는 것으로 알려진 격리 이동성 내부기생충입니다. 본 연구에서는 할로겐화 인돌의 소나무 선충류에 대한 살선충 활성과 작용 기전을 검토합니다. 5-요오드인돌과 아버멕틴(양성 대조군)의 소나무 선충류에 대한 살선충 활성은 저농도(10 μg/mL)에서 유사하고 높은 것으로 나타났습니다. 5-요오드인돌은 다산성, 생식 활성, 배아 및 유충 사망률, 그리고 운동 행동을 감소시켰습니다. 무척추동물 특이적 글루탐산-개폐형 염화물 채널 수용체와 리간드의 분자적 상호작용은 아버멕틴과 마찬가지로 5-요오드인돌이 수용체 활성 부위에 단단히 결합한다는 가설을 뒷받침합니다. 5-요오드인돌은 또한 선충류에서 비정상적인 기관 붕괴/수축 및 공포화 증가를 포함한 다양한 표현형 변형을 유도했습니다. 이러한 결과는 액포가 선충류의 메틸화 매개 사멸에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 중요한 점은 5-요오드인돌이 양배추와 무 두 식물 종 모두에 독성이 없었다는 것입니다. 따라서 본 연구는 환경 조건에서 요오드인돌을 처리하면 소나무 시들음병 피해를 효과적으로 방제할 수 있음을 보여줍니다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 소나무재선충류(PWN)에 속하며, 소나무림 생태계에 심각한 생태적 피해를 입히는 것으로 알려져 있습니다.1 이 소나무재선충에 의한 소나무재선충병(PWD)은 아시아와 유럽을 포함한 여러 대륙에서 심각한 문제가 되고 있으며, 북미에서는 이 선충이 외래 소나무 종을 파괴하고 있습니다.1,2 소나무 쇠퇴는 심각한 경제적 문제이며, 전 세계로 확산될 전망은 우려스럽습니다.3 이 선충에 가장 많이 공격받는 소나무 종은 Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, Pinus radiata입니다.4 소나무재선충은 감염 후 몇 주 또는 몇 달 안에 소나무를 고사시킬 수 있는 심각한 질병입니다. 또한 소나무 선충류의 발생은 다양한 생태계에서 흔하게 발생하기 때문에 지속적인 감염 사슬이 확립되었습니다.1.
부르사펠렌쿠스 자일로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)는 아펠렌코이데아(Aphelenchoidea) 상과 102.5번 분기군에 속하는 격리 식물기생성 선충입니다. 이 선충은 균류를 먹고 소나무 목재 조직에서 번식하며, L1, L2, L3, L4의 네 가지 유충 단계와 성충으로 발달합니다.1,6 식량 부족 상황에서 소나무 선충은 특수한 유충 단계인 다우어(dauer)로 이행하여 매개체인 소나무껍질딱정벌레(Monochamus alternatus)를 기생하고 건강한 소나무로 옮겨집니다. 건강한 숙주에서는 선충이 식물 조직을 빠르게 이동하며 유조직 세포를 섭취합니다. 이로 인해 여러 가지 과민 반응, 소나무 시들음병, 그리고 감염 후 1년 이내에 폐사가 발생합니다.1,7,8
소나무 선충류의 생물학적 방제는 오랫동안 어려운 과제였으며, 검역 조치는 20세기로 거슬러 올라갑니다. 현재 소나무 선충류 방제를 위한 전략은 주로 목재 훈증 및 나무줄기에 선충제를 이식하는 등 화학적 처리를 포함합니다. 가장 일반적으로 사용되는 선충제는 아베르멕틴과 아베르멕틴 벤조에이트로, 모두 아베르멕틴 계열에 속합니다. 이러한 값비싼 화학 물질은 많은 선충류 종에 매우 효과적이며 환경적으로 안전한 것으로 간주됩니다.9 그러나 이러한 선충제를 반복적으로 사용하면 선택 압력이 발생하여 저항성 소나무 선충류가 출현할 가능성이 매우 높습니다. 이는 Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella, 그리고 아베르멕틴에 대한 저항성을 점진적으로 발달시킨 선충류인 Trichostrongylus colubriformis와 Ostertagia circumcincta에서 입증되었습니다.10,11,12. 따라서 PVD를 방제할 수 있는 대안적이고 비용 효율적이며 환경 친화적인 방안을 찾기 위해서는 저항성 패턴을 정기적으로 연구하고 살선충제를 지속적으로 검토해야 합니다. 최근 수십 년 동안 많은 연구자들이 식물 추출물, 에센셜 오일, 휘발성 물질을 선충 방제제로 사용할 것을 제안해 왔습니다.13,14,15,16.
최근 저희는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 세포간 및 계간 신호전달 분자인 인돌의 살선충 활성을 입증했습니다. 17 인돌은 미생물 생태학에서 널리 분포하는 세포내 신호전달 물질로, 미생물 생리, 포자 형성, 플라스미드 안정성, 약물 저항성, 바이오필름 형성 및 병독성에 영향을 미치는 수많은 기능을 조절합니다. 18, 19 다른 병원성 선충에 대한 인돌 및 그 유도체의 활성은 연구되지 않았습니다. 본 연구에서는 소나무 선충에 대한 34종의 인돌의 살선충 활성을 조사하고, 현미경, 저속 촬영, 분자 도킹 실험을 통해 가장 강력한 5-요오드인돌의 작용 기전을 규명했으며, 종자 발아 검정을 통해 식물에 대한 독성 효과를 평가했습니다.
고농도(>1.0 mM)의 인돌은 선충류에 대한 살선충 효과가 있는 것으로 이전에 보고되었습니다. B. xylophilus(혼합 생활 단계)에 인돌 또는 33가지 다른 인돌 유도체를 1 mM 농도로 처리한 후, 대조군과 처리군의 생존 선충류와 사망 선충류를 계수하여 B. xylophilus의 사망률을 측정했습니다. 5가지 인돌은 유의미한 살선충 활성을 나타냈으며, 처리하지 않은 대조군의 생존율은 24시간 후 95 ± 7%였습니다. 시험한 34가지 인돌 중 1 mM 농도의 5-요오드인돌과 4-플루오로인돌은 100%의 사망률을 초래한 반면, 5,6-디플루오로인디고, 메틸인돌-7-카르복실레이트, 7-요오드인돌은 약 50%의 사망률을 초래했습니다(표 1).
5-요오드인돌이 소나무재선충의 액포 형성 및 대사에 미치는 영향. (A) 아베르멕틴과 5-요오드인돌이 성충 수컷 선충에 미치는 영향, (B) L1기 선충 알, (C) B. xylophilus의 대사. (i) 0시간에는 액포가 관찰되지 않았으나, 처리 후 (ii) 액포 형성, (iii) 다수의 액포 축적, (iv) 액포 부종, (v) 액포 융합, (vi) 거대 액포 형성이 관찰되었다. 빨간색 화살표는 액포 부종을, 파란색 화살표는 액포 융합을, 검은색 화살표는 거대 액포 형성을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.
또한, 이 연구는 소나무 선충류에서 메탄으로 유도된 사망의 순차적 과정을 설명했습니다(그림 4C). 메탄 생성 사망은 눈에 띄는 세포질 액포의 축적과 관련된 비아포토시스 유형의 세포 사망입니다. 소나무 선충류에서 관찰된 형태학적 결함은 메탄으로 유도된 사망 메커니즘과 밀접한 관련이 있는 것으로 보입니다. 여러 시점에서 현미경 검사를 한 결과, 5-요오드인돌(0.1 mM)에 노출된 후 20시간 후에 거대한 액포가 형성되었습니다. 미세한 액포는 처리 8시간 후에 관찰되었고, 그 수는 12시간 후에 증가했습니다. 14시간 후에 여러 개의 큰 액포가 관찰되었습니다. 처리 12~16시간 후에 여러 개의 융합된 액포가 명확하게 보였으며, 이는 액포 융합이 메탄 생성 사망 메커니즘의 기초임을 시사합니다. 20시간 후에, 벌레 전체에서 여러 개의 거대한 액포가 발견되었습니다. 이러한 관찰 결과는 C. elegans의 배아분열에 대한 최초의 보고입니다.
5-요오드인돌을 처리한 벌레에서는 액포 응집 및 파열이 관찰되었는데(그림 5), 이는 벌레가 구부러지고 액포가 환경으로 방출되는 것으로 입증되었습니다. 부화 과정에서 L2에 의해 정상적으로 보존되는 난각막에서도 액포 파괴가 관찰되었습니다(보충 그림 S2). 이러한 관찰 결과는 액포 형성 및 화농 과정에 체액 축적, 삼투압 조절 장애, 그리고 가역적 세포 손상(RCI)이 관여함을 뒷받침합니다(그림 5).
관찰된 액포 형성에 요오드가 중요한 역할을 한다는 가설을 세우고, 요오드화나트륨(NaI)과 요오드화칼륨(KI)의 살선충 활성을 조사했습니다. 그러나 농도(0.1, 0.5 또는 1 mM)에서는 선충의 생존이나 액포 형성에 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 S5). 반면, 5-요오드인돌과 마찬가지로 7-요오드인돌(1 또는 2 mM)은 여러 액포 형성과 구조적 변형을 유도했습니다(보충 그림 S6). 두 요오드인돌은 소나무 선충에서 유사한 표현형 특성을 보였지만, NaI와 KI는 그렇지 않았습니다. 흥미롭게도, 인돌은 시험 농도에서 B. xylophilus에서 액포 형성을 유도하지 않았습니다(데이터 미제시). 따라서 이 결과는 인돌-요오드 복합체가 B. xylophilus의 공포화와 대사를 담당한다는 것을 확인시켜 주었습니다.
선충 살충 활성을 시험한 인돌 중 5-요오드인돌의 슬립 지수가 -5.89kcal/mol로 가장 높았고, 그 다음으로 7-요오드인돌(-4.48kcal/mol), 4-플루오로인돌(-4.33), 인돌(-4.03) 순이었다(그림 6). 5-요오드인돌은 류신 218과 강력한 골격 수소 결합을 통해 결합이 안정화되는 반면, 다른 모든 인돌 유도체는 측쇄 수소 결합을 통해 세린 260과 결합한다. 다른 모델링된 요오드인돌 중 2-요오드인돌은 -5.248 kcal/mol의 결합 값을 가지는데, 이는 류신 218과의 주요 수소 결합 때문입니다. 다른 알려진 결합으로는 3-요오드인돌(-4.3 kcal/mol), 4-요오드인돌(-4.0 kcal/mol), 6-플루오로인돌(-2.6 kcal/mol)이 있습니다(보충 그림 S8). 대부분의 할로겐화된 인돌과 인돌 자체는 5-요오도인돌과 2-요오도인돌을 제외하고 세린 260과 결합을 형성합니다. 이버멕틴에서 관찰된 것처럼 류신 218과 수소 결합이 효율적인 수용체-리간드 결합을 나타낸다는 사실(보충 그림 S7)은 이버멕틴과 마찬가지로 5-요오도인돌과 2-요오도인돌이 류신 218을 통해 GluCL 수용체의 활성 부위에 단단히 결합한다는 것을 확인합니다(그림 6 및 보충 그림 S8). 우리는 이러한 결합이 GluCL 복합체의 열린 기공 구조를 유지하는 데 필요하며, 5-요오도인돌, 2-요오도인돌, 아베르멕틴 및 이버멕틴이 GluCL 수용체의 활성 부위에 단단히 결합함으로써 이온 채널을 열어두고 유체 흡수를 허용한다고 제안합니다.
인돌과 할로겐화 인돌의 GluCL 분자 도킹. (A) 인돌, (B) 4-플루오로인돌, (C) 7-요오드인돌, (D) 5-요오드인돌 리간드가 GluCL 활성 부위에 결합하는 방향. 단백질은 리본으로 표시되었으며, 골격 수소 결합은 노란색 점선으로 표시되어 있습니다. (A′), (B′), (C′), (D′)는 해당 리간드와 주변 아미노산 잔기의 상호작용을 나타내며, 측쇄 수소 결합은 분홍색 점선 화살표로 표시되어 있습니다.
양배추와 무 씨앗의 발아에 대한 5-요오드인돌의 독성 효과를 평가하기 위해 실험을 수행했습니다. 5-요오드인돌(0.05 또는 0.1 mM) 또는 아베르멕틴(10 μg/mL)은 초기 발아 및 묘목 출현에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았습니다(그림 7). 또한, 처리하지 않은 대조군과 5-요오드인돌 또는 아베르멕틴으로 처리한 씨앗의 발아율 사이에는 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. 주근 신장 및 형성된 측근 수에 대한 효과는 미미했지만, 5-요오드인돌 1 mM(활성 농도의 10배)은 측근의 발달을 약간 지연시켰습니다. 이러한 결과는 5-요오드인돌이 식물 세포에 독성이 없으며 연구된 농도에서 식물 발달 과정을 방해하지 않음을 나타냅니다.
5-요오드인돌이 종자 발아에 미치는 영향. 아버멕틴 또는 5-요오드인돌을 첨가하거나 첨가하지 않은 무라시게 및 스쿠그 한천 배지에서 B. oleracea와 R. raphanistrum 종자의 발아, 싹틔움 및 측근을 관찰하였다. 22°C에서 3일간 배양한 후 발아를 기록하였다.
이 연구는 인돌에 의한 선충류 살상 사례를 여러 건 보고합니다. 중요한 것은, 요오드인돌이 솔잎에서 메틸화(작은 액포가 축적되어 점차 거대한 액포로 합쳐지고, 결국 막이 파열되어 죽는 과정)를 유도한다는 최초의 보고라는 점입니다. 요오드인돌은 시판되는 선충제인 아베르멕틴과 유사한 유의미한 살선충 특성을 보입니다.
인돌은 이전에 원핵생물과 진핵생물에서 바이오필름 억제/형성, 세균 생존, 병원성 등 다양한 신호전달 기능을 발휘하는 것으로 보고되었습니다19,32,33,34. 최근 할로겐화 인돌, 인돌 알칼로이드, 그리고 반합성 인돌 유도체의 잠재적 치료 효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있습니다35,36,37. 예를 들어, 할로겐화 인돌은 지속성 대장균(Escherichia coli)과 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 세포를 사멸시키는 것으로 나타났습니다37. 또한, 다른 종, 속, 그리고 계(界)에 대한 할로겐화 인돌의 효능을 연구하는 것은 과학적 관심사이며, 본 연구는 이러한 목표를 달성하기 위한 한 걸음입니다.
본 연구에서는 가역적 세포 손상(RCI)과 메틸화(그림 4C 및 5)를 기반으로 C. elegans에서 5-요오드인돌 유도 치사 기전을 제시한다. 부종 및 액포 변성과 같은 부종성 변화는 RCI와 메틸화의 지표이며, 세포질 내 거대 액포로 나타난다48,49. RCI는 ATP 생성을 감소시키고, ATPase 펌프 기능을 저하시키며, 세포막을 파괴하여 Na+, Ca2+, 그리고 수분의 급격한 유입을 유발함으로써 에너지 생성을 방해한다50,51,52. 세포질 내 액포는 동물 세포에서 Ca2+와 수분의 유입으로 인해 세포질 내 체액이 축적되어 발생한다53. 흥미로운 점은, 손상이 일시적이고 세포가 일정 기간 동안 ATP를 생산하기 시작하면 이러한 세포 손상 메커니즘이 가역적이지만, 손상이 지속되거나 악화되면 세포가 죽는다는 것입니다.54 우리의 관찰 결과에 따르면 5-요오드인돌로 처리한 선충은 스트레스 조건에 노출된 후 정상적인 생합성을 회복할 수 없습니다.
B. xylophilus에서 5-요오드인돌에 의해 유도된 메틸화 표현형은 요오드의 존재와 그 분자 분포 때문일 수 있는데, 7-요오드인돌은 5-요오드인돌보다 B. xylophilus에 대한 억제 효과가 약했기 때문이다(표 1 및 보충 그림 S6). 이러한 결과는 Maltese 등(2014)의 연구와 부분적으로 일치한다. Maltese 등은 인돌의 피리딜 질소 부분을 파라위치에서 메타위치로 이동시키면 U251 세포에서 공포화, 성장 억제 및 세포독성이 사라진다고 보고했는데, 이는 해당 분자와 단백질의 특정 활성 부위의 상호작용이 중요함을 시사한다. 본 연구에서 관찰된 인돌 또는 할로겐화 인돌과 GluCL 수용체 간의 상호작용 또한 이러한 가설을 뒷받침합니다. 5-요오드인돌과 2-요오드인돌은 다른 인돌보다 GluCL 수용체에 더 강하게 결합하는 것으로 나타났습니다(그림 6 및 보충 그림 S8). 인돌의 두 번째 또는 다섯 번째 위치에 있는 요오드는 GluCL 수용체의 류신 218번과 골격 수소 결합을 통해 결합하는 반면, 다른 할로겐화 인돌과 인돌 자체는 세린 260번과 약한 측쇄 수소 결합을 형성합니다(그림 6). 따라서 할로겐의 국소화가 액포 변성 유도에 중요한 역할을 하는 반면, 5-요오드인돌의 강한 결합은 이온 채널을 열어 두어 빠른 체액 유입과 액포 파열을 가능하게 한다고 추정합니다. 그러나 5-요오드인돌의 자세한 작용 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다.
5-요오드인돌을 실제 적용하기 전에 식물에 미치는 독성 영향을 분석해야 합니다. 본 연구에서는 종자 발아 실험을 통해 연구 농도에서 5-요오드인돌이 종자 발아 및 이후 발달 과정에 부정적인 영향을 미치지 않음을 확인했습니다(그림 7). 따라서 본 연구는 소나무 선충류의 소나무에 대한 유해성을 제어하기 위해 생태 환경에서 5-요오드인돌을 활용할 수 있는 근거를 제공합니다.
이전 연구에서는 인돌 기반 치료법이 항생제 내성 및 암 진행 문제를 해결하는 잠재적인 접근법임을 입증했습니다.55 또한, 인돌은 항균, 항암, 항산화, 항염증, 항당뇨, 항바이러스, 항증식 및 항결핵 활성을 가지고 있어 약물 개발의 유망한 기반이 될 수 있습니다.56,57 본 연구는 요오드를 항기생충 및 구충제로 사용할 수 있는 가능성을 최초로 제시합니다.
아버멕틴은 30년 전에 발견되어 2015년 노벨상을 수상했으며, 구충제로서의 활용은 여전히 활발히 진행 중입니다. 그러나 선충류와 해충에서 아버멕틴에 대한 내성이 빠르게 발달함에 따라, 소나무의 소나무좀나방(PWN) 감염을 방제하기 위한 대안적이고 저렴하며 환경 친화적인 전략이 필요합니다. 또한, 본 연구에서는 5-요오드인돌이 소나무 선충류를 사멸시키는 기전을 규명하고, 5-요오드인돌이 식물 세포에 대한 독성이 낮다는 사실을 밝혀내어 향후 상업적 활용 가능성을 제시합니다.
모든 실험은 대한민국 경산에 위치한 영남대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 실험 방법은 영남대학교 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
알 부화 실험은 확립된 절차43를 사용하여 수행되었습니다. 부화율(HR)을 평가하기 위해 1일령 성충 선충(암컷 약 100마리, 수컷 약 100마리)을 균류가 담긴 페트리 접시로 옮겨 24시간 동안 성장시켰습니다. 그런 다음 알을 분리하여 멸균 증류수에 현탁액으로 5-요오드인돌(0.05 mM 및 0.1 mM) 또는 아버멕틴(10 μg/ml)을 처리했습니다. 이 현탁액(500 μl, 알 약 100개)을 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 옮겨 22°C에서 배양했습니다. 배양 24시간 후 L2 계수를 수행했지만, 가는 백금선으로 자극했을 때 세포가 움직이지 않으면 죽은 것으로 간주했습니다. 이 실험은 두 단계로 진행되었으며, 각 단계는 6회 반복되었습니다. 두 실험의 데이터를 합산하여 제시했습니다. HR 백분율은 다음과 같이 계산합니다.
유충 사망률은 기존에 개발된 절차를 사용하여 평가했습니다. 선충 알을 수집하고, 멸균 증류수에서 부화시켜 배아를 동기화하여 L2 단계 유충을 생성했습니다. 동기화된 유충(약 500마리의 선충)에 5-요오드인돌(0.05 mM 및 0.1 mM) 또는 아베르멕틴(10 μg/ml)을 처리하고 B. cinerea 페트리 접시에서 사육했습니다. 22°C에서 48시간 동안 배양한 후, 멸균 증류수에 선충을 수집하여 L2, L3, L4 단계의 존재 여부를 검사했습니다. L3 및 L4 단계의 존재는 유충 형질 전환을 나타내며, L2 단계의 존재는 형질 전환이 없음을 나타냅니다. 이미지는 iRiS™ 디지털 세포 이미징 시스템을 사용하여 획득했습니다. 이 실험은 각각 6회 반복되는 두 단계로 수행되었습니다. 두 실험의 데이터를 결합하여 제시했습니다.
5-요오드인돌과 아베르멕틴의 종자 독성은 무라시게와 스쿠그 한천 평판 배지에서 발아 시험을 통해 평가했습니다.62 B. oleracea와 R. raphanistrum 종자를 먼저 멸균 증류수에 하루 동안 담가둔 다음 100% 에탄올 1ml로 세척하고, 50% 상업용 표백제(3% 차아염소산나트륨) 1ml로 15분간 멸균한 다음 멸균수 1ml로 5번 세척했습니다. 멸균한 종자를 0.86g/l(0.2X) 무라시게와 스쿠그 배지와 5-요오드인돌 또는 아베르멕틴이 있거나 없는 0.7% 세균 한천이 들어 있는 발아 한천 평판 배지에 압착했습니다. 평판을 22°C에서 배양한 다음 배양 3일 후에 이미지를 촬영했습니다. 이 실험은 두 단계로 진행했으며, 각 단계는 6번 반복했습니다.
게시 시간: 2025년 2월 26일