소나무선충은 소나무림 생태계에 심각한 경제적 손실을 초래하는 검역 대상 이동성 내부기생충입니다. 본 연구는 할로겐화 인돌 화합물의 소나무선충에 대한 살선충 활성 및 작용 기전을 검토했습니다. 5-요오드인돌과 아버멕틴(양성 대조군)은 낮은 농도(10 μg/mL)에서 소나무선충에 대해 유사하고 높은 살선충 활성을 나타냈습니다. 5-요오드인돌은 번식력, 생식 활동, 배아 및 유충 사망률, 그리고 운동성을 감소시켰습니다. 리간드와 무척추동물 특이적 글루타메이트 개폐형 염화물 채널 수용체의 분자적 상호작용은 5-요오드인돌이 아버멕틴과 마찬가지로 수용체 활성 부위에 강하게 결합한다는 것을 뒷받침합니다. 또한 5-요오드인돌은 소나무선충에서 비정상적인 장기 붕괴/수축 및 액포 형성 증가를 포함한 다양한 표현형 변형을 유도했습니다. 이러한 결과는 액포가 선충의 메틸화 매개 사망에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 특히, 5-요오드인돌은 양배추와 무 두 식물 종 모두에 대해 독성이 없었습니다. 따라서 본 연구는 환경 조건에서 요오드인돌을 처리하면 소나무 시들음병 피해를 방제할 수 있음을 보여줍니다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 소나무재선충속(PWN)에 속하는 이동성 내부기생선충으로, 소나무림 생태계에 심각한 생태적 피해를 일으키는 것으로 알려져 있습니다.1 소나무재선충에 의해 발생하는 소나무시들음병(PWD)은 아시아와 유럽을 비롯한 여러 대륙에서 심각한 문제로 대두되고 있으며, 북미에서는 도입된 소나무 종을 파괴하고 있습니다.1,2 소나무 고사는 주요 경제적 손실이며, 전 세계적인 확산 가능성이 우려스럽습니다.3 소나무재선충의 주요 공격 대상 소나무 종은 덴시플로라(Pinus densiflora), 실베스트리스(Pinus sylvestris), 툰베르기(Pinus thunbergii), 코라이엔시스(Pinus koraiensis), 라디아타(Pinus radiata)입니다.4 소나무재선충병은 감염 후 수주 또는 수개월 내에 소나무를 고사시킬 수 있는 심각한 질병입니다. 또한, 소나무선충 발생은 다양한 생태계에서 흔히 나타나므로 지속적인 감염 사슬이 형성되었습니다.
Bursaphelenchus xylophilus는 Aphelenchoidea 상과 102.5 계통에 속하는 검역 대상 식물 기생 선충입니다. 이 선충은 곰팡이를 먹고 소나무의 목질 조직에서 번식하며, L1, L2, L3, L4의 네 단계 유충과 성충으로 발달합니다.1,6 먹이가 부족한 환경에서 소나무선충은 특수한 유충 단계인 다우어(dauer)로 변태하여 매개체인 소나무껍질딱정벌레(Monochamus alternatus)에 기생하고 건강한 소나무로 옮겨집니다. 건강한 숙주에서 선충은 식물 조직을 빠르게 이동하며 유조직 세포를 섭취하여 과민 반응, 소나무 시들음병, 감염 후 1년 이내에 고사를 유발합니다.1,7,8
소나무선충의 생물학적 방제는 오랫동안 어려운 과제였으며, 20세기부터 검역 조치가 시행되어 왔습니다. 현재 소나무선충 방제 전략은 주로 목재 훈증 및 나무줄기에 살선충제를 주입하는 등의 화학적 처리에 의존합니다. 가장 흔하게 사용되는 살선충제는 아버멕틴 계열에 속하는 아버멕틴과 아버멕틴 벤조에이트입니다. 이러한 고가의 화학물질은 많은 선충 종에 대해 매우 효과적이며 환경적으로도 안전한 것으로 여겨집니다.9 그러나 이러한 살선충제를 반복적으로 사용하면 선택압이 발생하여 저항성 소나무선충이 출현할 가능성이 매우 높습니다. 이는 Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella와 같은 해충과 Trichostrongylus colubriformis 및 Ostertagia circumcincta와 같은 선충에서 아버멕틴에 대한 저항성이 점진적으로 발달한 사례에서 입증되었습니다.10,11,12 따라서 PVD를 제어하기 위한 대안적이고 비용 효율적이며 환경 친화적인 조치를 찾기 위해서는 저항성 패턴을 정기적으로 연구하고 살선충제를 지속적으로 선별해야 합니다. 최근 수십 년 동안 많은 연구자들이 식물 추출물, 에센셜 오일 및 휘발성 물질을 선충 방제제로 사용하는 것을 제안했습니다.13,14,15,16
최근 우리는 세포간 및 종간 신호 전달 분자인 인돌이 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 살선충 활성을 나타낸다는 것을 입증했습니다. 17 인돌은 미생물 생태계에서 널리 분포하는 세포 내 신호 전달 물질로, 미생물 생리, 포자 형성, 플라스미드 안정성, 약물 내성, 생물막 형성 및 병원성 등 다양한 기능을 조절합니다. 18, 19 그러나 다른 병원성 선충에 대한 인돌 및 그 유도체의 활성은 아직 연구되지 않았습니다. 본 연구에서는 34가지 인돌 화합물의 소나무선충에 대한 살선충 활성을 조사하고, 현미경 관찰, 타임랩스 촬영 및 분자 도킹 실험을 통해 가장 강력한 활성을 나타낸 5-요오도인돌의 작용 메커니즘을 규명했으며, 종자 발아 시험을 통해 식물에 미치는 독성 효과를 평가했습니다.
고농도(>1.0 mM)의 인돌은 선충에 대한 살선충 효과가 있는 것으로 이전에 보고되었습니다.17 B. xylophilus(혼합 생활 단계)를 1 mM 농도의 인돌 또는 33가지 인돌 유도체로 처리한 후, 대조군과 처리군에서 살아있는 선충과 죽은 선충의 수를 세어 B. xylophilus의 사망률을 측정했습니다. 5가지 인돌이 유의미한 살선충 활성을 나타냈으며, 처리하지 않은 대조군의 생존율은 24시간 후 95 ± 7%였습니다. 시험한 34가지 인돌 중 5-요오도인돌과 4-플루오로인돌은 1 mM 농도에서 100%의 사망률을 유발한 반면, 5,6-디플루오로인디고, 메틸인돌-7-카르복실레이트, 7-요오도인돌은 약 50%의 사망률을 유발했습니다(표 1).
5-요오드인돌이 소나무재선충의 액포 형성 및 대사에 미치는 영향. (A) 아버멕틴과 5-요오드인돌이 성체 수컷 소나무재선충에 미치는 영향, (B) L1 유충 단계의 선충 알, (C) 소나무재선충의 대사에 미치는 영향. (i) 0시간에는 액포가 관찰되지 않았으며, 처리 후 (ii) 액포 형성, (iii) 다수의 액포 축적, (iv) 액포 팽창, (v) 액포 융합, (vi) 거대 액포 형성이 관찰되었다. 붉은색 화살표는 액포 팽창, 파란색 화살표는 액포 융합, 검은색 화살표는 거대 액포를 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.
또한, 본 연구에서는 소나무선충에서 메탄에 의한 사망의 순차적 과정을 기술했습니다(그림 4C). 메탄생성 사망은 세포질에 뚜렷한 액포가 축적되는 것과 관련된 비세포사멸성 세포사멸 유형입니다.27 소나무선충에서 관찰된 형태학적 결함은 메탄생성 사망 기전과 밀접한 관련이 있는 것으로 보입니다. 다양한 시간대에 현미경으로 관찰한 결과, 5-요오드인돌(0.1 mM)에 20시간 노출 후 거대 액포가 형성되었습니다. 처리 8시간 후 미세 액포가 관찰되었고, 12시간 후에는 그 수가 증가했습니다. 14시간 후에는 여러 개의 큰 액포가 관찰되었습니다. 처리 12~16시간 후에는 여러 개의 융합된 액포가 명확하게 관찰되어 액포 융합이 메탄생성 사망 기전의 핵심임을 시사합니다. 20시간 후에는 선충 전체에서 여러 개의 거대 액포가 발견되었습니다. 이러한 관찰 결과는 예쁜꼬마선충에서 메투오시스가 발생했다는 첫 번째 보고입니다.
5-요오드인돌로 처리한 벌레에서는 액포 응집 및 파열이 관찰되었으며(그림 5), 이는 벌레의 굽힘과 액포가 환경으로 방출되는 것으로 확인되었습니다. 또한, 부화 과정에서 L2 유충에 의해 온전하게 유지되는 난각막에서도 액포 파괴가 관찰되었습니다(보충 그림 S2). 이러한 관찰 결과는 액포 형성 및 화농 과정에 체액 축적, 삼투압 조절 장애, 그리고 가역적 세포 손상(RCI)이 관여함을 뒷받침합니다(그림 5).
관찰된 액포 형성에 요오드가 관여한다는 가설을 세우고, 요오드화나트륨(NaI)과 요오드화칼륨(KI)의 살선충 활성을 조사했습니다. 그러나 0.1, 0.5 또는 1 mM 농도에서 이들은 선충의 생존이나 액포 형성에 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 S5). 다만 1 mM KI는 약간의 살선충 효과를 보였습니다. 반면, 7-요오드인돌(1 또는 2 mM)은 5-요오드인돌과 마찬가지로 다수의 액포 형성과 구조적 변형을 유도했습니다(보충 그림 S6). 두 요오드인돌은 소나무선충에서 유사한 표현형적 특성을 보였지만, NaI와 KI는 그렇지 않았습니다. 흥미롭게도, 인돌은 시험한 농도에서 B. xylophilus에서는 액포 형성을 유도하지 않았습니다(데이터는 제시하지 않음). 따라서, 이러한 결과는 인돌-요오드 복합체가 B. xylophilus의 액포 형성 및 대사에 관여한다는 것을 확인시켜 주었다.
살선충 활성을 테스트한 인돌 화합물 중에서 5-요오도인돌이 -5.89 kcal/mol로 가장 높은 슬립 지수를 나타냈으며, 그 다음으로 7-요오도인돌(-4.48 kcal/mol), 4-플루오로인돌(-4.33), 인돌(-4.03) 순이었다(그림 6). 5-요오도인돌은 류신 218과 강력한 주쇄 수소 결합을 형성하여 결합을 안정화시키는 반면, 다른 모든 인돌 유도체는 측쇄 수소 결합을 통해 세린 260에 결합한다. 모델링된 다른 요오드인돌 중에서 2-요오드인돌은 -5.248 kcal/mol의 결합 값을 가지는데, 이는 류신 218과의 주요 수소 결합 때문입니다. 다른 알려진 결합에는 3-요오드인돌(-4.3 kcal/mol), 4-요오드인돌(-4.0 kcal/mol) 및 6-플루오로인돌(-2.6 kcal/mol)이 포함됩니다(보충 그림 S8). 5-요오드인돌과 2-요오드인돌을 제외한 대부분의 할로겐화 인돌과 인돌 자체는 세린 260과 결합합니다. 이버멕틴에서 관찰된 바와 같이(보충 그림 S7), 류신 218과의 수소 결합이 효율적인 수용체-리간드 결합을 나타낸다는 사실은 5-요오드인돌과 2-요오드인돌이 이버멕틴처럼 류신 218을 통해 GluCL 수용체의 활성 부위에 단단히 결합함을 확인시켜 줍니다(그림 6 및 보충 그림 S8). 우리는 이러한 결합이 GluCL 복합체의 열린 기공 구조를 유지하는 데 필요하며, 5-요오드인돌, 2-요오드인돌, 아베르멕틴 및 이버멕틴이 GluCL 수용체의 활성 부위에 단단히 결합함으로써 이온 채널을 열린 상태로 유지하고 체액 흡수를 가능하게 한다고 제안합니다.
인돌 및 할로겐화 인돌과 GluCL의 분자 도킹. (A) 인돌, (B) 4-플루오로인돌, (C) 7-요오도인돌, (D) 5-요오도인돌 리간드가 GluCL 활성 부위에 결합하는 방향. 단백질은 리본으로 표현되었고, 주쇄 수소 결합은 노란색 점선으로 표시되었다. (A′), (B′), (C′), (D′)는 해당 리간드와 주변 아미노산 잔기 사이의 상호작용을 보여주며, 측쇄 수소 결합은 분홍색 점선 화살표로 표시되었다.
5-요오드인돌이 양배추와 무 종자의 발아에 미치는 독성 효과를 평가하기 위해 실험을 수행했습니다. 5-요오드인돌(0.05 또는 0.1 mM) 또는 아버멕틴(10 μg/mL)은 초기 발아 및 유묘 출현에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았습니다(그림 7). 또한, 무처리 대조군과 5-요오드인돌 또는 아버멕틴 처리 종자의 발아율에는 유의미한 차이가 없었습니다. 주근 신장 및 측근 형성 수에 미치는 영향은 미미했지만, 5-요오드인돌 1 mM(활성 농도의 10배)은 측근 발달을 약간 지연시켰습니다. 이러한 결과는 5-요오드인돌이 식물 세포에 독성이 없으며 연구된 농도 범위에서 식물 발달 과정을 방해하지 않음을 시사합니다.
5-요오드인돌이 종자 발아에 미치는 영향. 아베르멕틴 또는 5-요오드인돌을 첨가하거나 첨가하지 않은 무라시게-스코그 한천 배지에서 바구미(B. oleracea)와 로테라피(R. raphanistrum) 종자의 발아, 싹틔움 및 측근 발생을 관찰하였다. 발아율은 22°C에서 3일간 배양 후 기록하였다.
본 연구는 인돌 화합물에 의한 선충 사멸 사례를 여러 건 보고한다. 특히, 요오드인돌이 소나무 잎에서 메틸화(작은 액포들이 점차 거대 액포로 합쳐져 결국 막 파열과 사멸을 초래하는 과정)를 유도한다는 사실을 최초로 보고한 것이며, 요오드인돌은 시판되는 살선충제인 아베르멕틴과 유사한 강력한 살선충 효과를 나타냈다.
인돌은 이전에 원핵생물과 진핵생물에서 생물막 억제/형성, 세균 생존 및 병원성 등 다양한 신호 전달 기능을 하는 것으로 보고되었습니다.19,32,33,34 최근에는 할로겐화 인돌, 인돌 알칼로이드 및 반합성 인돌 유도체의 잠재적인 치료 효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있습니다.35,36,37 예를 들어, 할로겐화 인돌은 내성 대장균과 황색포도상구균을 사멸시키는 것으로 나타났습니다.37 또한, 할로겐화 인돌의 다른 종, 속 및 계에 대한 효능을 연구하는 것은 과학적으로 중요한 과제이며, 본 연구는 이러한 목표를 달성하기 위한 첫걸음입니다.
본 연구에서는 가역적 세포 손상(RCI)과 메틸화에 기반한 5-요오드인돌 유도 C. elegans 치사 기전을 제안합니다(그림 4C 및 5). 부종성 변화(예: 세포 팽창 및 액포 변성)는 RCI 및 메틸화의 지표이며, 세포질 내 거대 액포로 나타납니다.48,49 RCI는 ATP 생산 감소, ATPase 펌프 기능 부전, 세포막 파괴 및 Na+, Ca2+, 수분의 급격한 유입을 통해 에너지 생산을 방해합니다.50,51,52 동물 세포에서 세포질 내 액포는 Ca2+ 및 수분의 유입으로 인한 세포질 내 체액 축적의 결과로 발생합니다.53 흥미롭게도, 이러한 세포 손상 메커니즘은 손상이 일시적이고 세포가 일정 기간 동안 ATP를 생성하기 시작하면 가역적이지만, 손상이 지속되거나 악화되면 세포는 죽습니다.54 우리의 관찰에 따르면 5-요오도인돌로 처리된 선충은 스트레스 조건에 노출된 후 정상적인 생합성을 회복할 수 없습니다.
B. xylophilus에서 5-요오도인돌에 의해 유도된 메틸화 표현형은 요오드의 존재 및 분자 분포 때문일 수 있는데, 이는 7-요오도인돌이 5-요오도인돌보다 B. xylophilus에 대한 억제 효과가 적었기 때문이다(표 1 및 보충 그림 S6). 이러한 결과는 인돌의 피리딜 질소 부분이 파라 위치에서 메타 위치로 이동하면 U251 세포에서 액포 형성, 성장 억제 및 세포 독성이 사라진다고 보고한 Maltese 등(2014)의 연구와 부분적으로 일치하며, 이는 분자가 단백질의 특정 활성 부위와 상호작용하는 것이 중요하다는 것을 시사한다27,44,45. 본 연구에서 관찰된 인돌 또는 할로겐화 인돌과 GluCL 수용체 간의 상호작용은 이러한 가설을 뒷받침합니다. 5-요오드인돌과 2-요오드인돌은 조사된 다른 인돌보다 GluCL 수용체에 더 강하게 결합하는 것으로 나타났습니다(그림 6 및 보충 그림 S8). 인돌의 두 번째 또는 다섯 번째 위치에 있는 요오드는 주쇄 수소 결합을 통해 GluCL 수용체의 류신 218과 결합하는 반면, 다른 할로겐화 인돌과 인돌 자체는 세린 260과 약한 측쇄 수소 결합을 형성합니다(그림 6). 따라서 할로겐의 위치가 액포 변성 유도에 중요한 역할을 하며, 5-요오드인돌의 강한 결합은 이온 채널을 열린 상태로 유지하여 빠른 체액 유입과 액포 파열을 유발하는 것으로 추측됩니다. 그러나 5-요오드인돌의 상세한 작용 메커니즘은 추가 연구를 통해 밝혀져야 합니다.
5-요오드인돌을 실제 적용하기 전에 식물에 미치는 독성 효과를 분석해야 합니다. 종자 발아 실험 결과, 5-요오드인돌은 실험에 사용된 농도 범위에서 종자 발아 및 이후 발달 과정에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(그림 7). 따라서 본 연구는 소나무선충의 소나무 수목 피해 방제를 위한 생태 환경에서 5-요오드인돌 사용에 대한 기초 자료를 제공합니다.
이전 연구에서는 인돌 기반 치료법이 항생제 내성 및 암 진행 문제를 해결할 수 있는 잠재적인 접근법임을 보여주었습니다.55 또한, 인돌은 항균, 항암, 항산화, 항염, 항당뇨, 항바이러스, 항증식 및 항결핵 활성을 가지고 있어 신약 개발의 유망한 기반이 될 수 있습니다.56,57 본 연구는 요오드를 항기생충 및 구충제로 사용할 수 있는 가능성을 처음으로 제시합니다.
아베르멕틴은 30여 년 전 발견되어 2015년 노벨상을 수상했으며, 구충제로 여전히 활발히 사용되고 있습니다. 그러나 선충과 해충에서 아베르멕틴에 대한 내성이 빠르게 발달함에 따라 소나무재선충(PWN) 감염을 방제할 수 있는 저렴하고 환경 친화적인 대체 전략이 필요합니다. 본 연구에서는 5-요오드인돌이 소나무재선충을 사멸시키는 기전을 규명하고, 식물 세포에 대한 독성이 낮다는 점을 밝혀내어 향후 상업적 응용 가능성을 제시합니다.
모든 실험은 한국 경산에 위치한 영남대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 실험 방법은 영남대학교 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
난 부화 실험은 확립된 절차43에 따라 수행되었습니다. 부화율(HR)을 평가하기 위해, 1일 된 성체 선충(암컷 약 100마리, 수컷 약 100마리)을 곰팡이가 들어 있는 페트리 접시에 옮겨 24시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 난을 분리하여 멸균 증류수에 현탁시킨 5-요오드인돌(0.05mM 및 0.1mM) 또는 아버멕틴(10μg/ml)으로 처리했습니다. 이 현탁액(500μl, 약 100개의 난)을 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮겨 22°C에서 배양했습니다. 24시간 배양 후 L2 유충 수를 측정했지만, 가는 백금선으로 자극했을 때 세포가 움직이지 않으면 죽은 것으로 간주했습니다. 이 실험은 각각 6회 반복하여 두 단계로 진행했습니다. 두 실험의 데이터를 통합하여 제시했습니다. 부화율(HR)은 다음과 같이 계산했습니다.
유충 사망률은 기존에 개발된 절차를 사용하여 평가했습니다. 선충 알을 수집하고 무균 증류수에서 부화시켜 배아를 동기화하여 L2 단계 유충을 생성했습니다. 동기화된 유충(약 500마리)에 5-요오드인돌(0.05mM 및 0.1mM) 또는 아버멕틴(10μg/ml)을 처리하고 바실러스 시네레아(B. cinerea) 배양 접시에 배양했습니다. 22°C에서 48시간 배양 후, 선충을 무균 증류수에 담아 L2, L3, L4 단계의 존재 여부를 확인했습니다. L3 및 L4 단계가 존재하면 유충 변태가 일어난 것으로, L2 단계가 존재하면 변태가 일어나지 않은 것으로 판단했습니다. 이미지는 iRiS™ 디지털 세포 이미징 시스템을 사용하여 획득했습니다. 이 실험은 6회 반복하여 두 단계로 진행했습니다. 두 실험의 데이터를 통합하여 제시했습니다.
5-요오드인돌과 아버멕틴의 종자 독성은 무라시게-스코그 한천 배지를 이용한 발아 시험을 통해 평가하였다.62 B. oleracea와 R. raphanistrum 종자를 먼저 멸균 증류수에 하루 동안 담근 후, 1ml의 100% 에탄올로 세척하고, 1ml의 50% 상업용 표백제(3% 차아염소산나트륨)에 15분간 담가 살균한 다음, 1ml의 멸균수로 다섯 번 세척하였다. 살균된 종자를 0.86g/l(0.2X)의 무라시게-스코그 배지와 0.7%의 세균 한천이 함유된 발아 한천 배지에 5-요오드인돌 또는 아버멕틴을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 압착하였다. 배지를 22°C에서 배양하고 3일 후 사진을 촬영하였다. 이 실험은 두 단계로 진행되었으며, 각 단계는 6회 반복되었다.
게시 시간: 2025년 2월 26일