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천연물의 발견과 유익한 활용은 인간의 삶을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 식물 생장 억제 화학물질은 잡초 방제를 위한 제초제로 널리 사용됩니다. 다양한 종류의 제초제를 사용해야 하므로, 새로운 작용 기전을 가진 화합물을 발굴할 필요성이 있습니다. 본 연구에서는 스트렙토마이세스 웨라엔시스 MK493-CF1에서 새로운 N-알콕시피롤 화합물인 쿠마모나마이드를 발견하고 완전한 합성 과정을 확립했습니다. 생물학적 활성 분석을 통해, urs-모노아믹산이 urs-모노아마이드의 합성 중간체이며 잠재적인식물 생장 억제제또한, 저희는 헬라 세포의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않으면서도 높은 제초 활성을 가진 우르베닐옥시 유도체(UDA)를 포함한 다양한 우르베논산 유도체를 개발했습니다. 또한, 우르모톤산 유도체가 식물 미세소관을 파괴하고, KAND가 액틴 필라멘트에 영향을 미쳐 세포 사멸을 유도한다는 사실을 발견했습니다. 이러한 다면적인 효과는 기존 미세소관 억제제와는 다르며, 우르소닉산의 새로운 작용 기전을 제시하는 것으로, 이는 새로운 제초제 개발에 중요한 이점을 제공합니다.
유익한 천연물과 그 유도체의 발견과 실용화는 인간 삶의 질을 향상시키는 중요한 수단입니다. 미생물, 식물, 곤충이 생산하는 이차 대사산물은 의학과 농업에 큰 발전을 가져왔습니다. 많은 항생제와 항백혈병 치료제가 천연물에서 개발되었습니다. 또한, 다양한 종류의살충제이러한 천연물에서 살균제와 제초제가 추출되어 농업에 사용됩니다. 특히 잡초 방제용 제초제는 현대 농업에서 작물 수확량을 증가시키는 중요한 도구이며, 다양한 종류의 화합물이 이미 상업적으로 사용되고 있습니다. 광합성, 아미노산 대사, 세포벽 합성, 세포 분열 조절, 식물 호르몬 신호 전달, 단백질 합성과 같은 식물의 여러 세포 과정이 제초제의 대표적인 표적입니다. 미세소관 기능을 억제하는 화합물은 세포 분열 조절에 영향을 미쳐 식물 생장에 영향을 미치는 일반적인 제초제입니다.
미세소관은 세포골격의 구성 요소이며 진핵세포에서 널리 보존되어 있습니다. 튜불린 이종이량체는 α-튜불린과 β-튜불린으로 구성되어 선형 미세소관 원형질 필라멘트를 형성하며, 13개의 원형질 필라멘트가 원통형 구조를 이룹니다. 미세소관은 식물 세포에서 세포 모양, 세포 분열, 세포 내 수송을 결정하는 등 다양한 역할을 합니다.3,4 식물 세포는 간기 세포막 아래에 미세소관을 가지고 있으며, 이 소위 피질 미세소관은 셀룰로스 합성효소 복합체의 조절을 통해 셀룰로스 미세섬유의 조직을 조절하는 것으로 알려져 있습니다.4,5 뿌리 끝의 급속 신장 영역에 존재하는 뿌리 표피 세포의 피질 미세소관은 측면에 위치하며, 셀룰로스 미세섬유는 이 미세소관을 따라가며 세포 확장 방향을 제한하여 비등방성 세포 신장을 촉진합니다. 따라서 미세소관의 기능은 식물 형태와 밀접한 관련이 있습니다. 튜불린을 암호화하는 유전자의 아미노산 치환은 애기장대에서 피질 미세소관 배열의 편향과 좌우 생장을 유발합니다(6,7). 마찬가지로, 미세소관 동역학을 조절하는 미세소관 관련 단백질의 돌연변이는 뿌리 생장 왜곡을 초래할 수 있습니다(8,9,10,11,12,13). 또한, 프레틸라클로르라고도 알려진 디소피라미드와 같은 미세소관 교란 제초제를 처리하면 뿌리가 좌측으로 사선 생장합니다(14). 이러한 결과는 미세소관 기능의 정확한 조절이 식물 생장 방향을 결정하는 데 중요함을 시사합니다.
다양한 유형의 미세소관 억제제가 발견되었으며, 이러한 약물들은 세포골격 연구뿐만 아니라 농업 및 의학 분야에도 상당한 기여를 해왔습니다. 특히 오리잘린, 디니트로아닐린 화합물, 디소피라미드, 벤즈아미드 관련 화합물 및 그 유사체는 미세소관 기능을 억제하여 식물 생장을 저해할 수 있습니다. 따라서 이러한 약물들은 제초제로 널리 사용됩니다. 그러나 미세소관은 식물 및 동물 세포의 중요한 구성 요소이기 때문에 대부분의 미세소관 억제제는 두 세포 모두에 세포독성을 나타냅니다. 따라서 제초제로서의 유용성이 인정됨에도 불구하고, 실제적인 목적으로 사용되는 항미세소관제는 제한적입니다.
스트렙토미세스(Streptomyces)는 호기성, 그람 양성, 사상균을 포함하는 스트렙토미세스과의 한 속이며, 다양한 이차 대사산물을 생성하는 능력으로 널리 알려져 있습니다. 따라서 새로운 생물학적 활성 천연물의 가장 중요한 공급원 중 하나로 여겨집니다. 본 연구에서는 스트렙토미세스 웨렌시스(Streptomyces werraensis) MK493-CF1과 S. 웨렌시스 ISP 5486에서 분리된 쿠마모나마이드(coumamonamide)라는 새로운 화합물을 발견했습니다. 스펙트럼 분석과 전체 스펙트럼 분석을 통해 쿠마모나마이드의 구조를 규명하고, 독특한 N-알콕시피롤 골격을 규명했습니다. 합성. 우르스모노아마이드와 그 유도체의 합성 중간체인 우르스몬산(Ursmonic acid)은 인기 있는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 생장과 발아를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 구조-활성 상관관계 연구에서, C9가 우르손산으로 변형된 화합물인 우르손산의 노닐옥시 유도체(KAND)가 생장 및 발아 억제 효과를 유의미하게 향상시킨다는 것을 발견했습니다. 특히, 새롭게 발견된 식물 생장 억제제는 담배와 우산이끼의 생장에도 영향을 미쳤으며, 박테리아나 HeLa 세포에는 세포독성을 나타내지 않았습니다. 더욱이, 일부 우르손산 유도체는 뿌리의 표현형을 왜곡시키는데, 이는 이러한 유도체가 미세소관에 직간접적으로 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 이러한 가설과 일치하게, 면역조직화학적으로 또는 형광 단백질로 표지된 미세소관에 대한 관찰 결과는 KAND 처리가 미세소관을 탈중합화함을 시사합니다. 또한, 쿠마모토산 유도체 처리는 액틴 미세섬유를 파괴했습니다. 따라서, 우리는 세포골격 파괴를 포함하는 독특한 작용 기전을 가진 새로운 식물 생장 억제제를 발견했습니다.
MK493-CF1 균주는 도쿄도 시나가와구 토양에서 분리되었습니다. MK493-CF1 균주는 분지가 잘 된 기질 균사체를 형성했습니다. 16S 리보솜 RNA 유전자(1422 bp)의 부분 서열이 결정되었습니다. 이 균주는 S. werraensis(NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: 전형적 균주, 99.93%)와 매우 유사합니다. 이 결과를 바탕으로 이 균주가 S. werraensis의 모균주와 밀접한 관련이 있음을 확인했습니다. 따라서 이 균주를 S. werraensis MK493-CF1로 가칭했습니다. S. werraensis ISP 5486T도 동일한 생리활성 화합물을 생성합니다. 이 미생물에서 천연물을 얻는 초기 연구는 거의 없었기 때문에 추가적인 화학적 연구가 수행되었습니다. S. werraensis MK493-CF1을 보리 배지에서 30°C 고체 발효법으로 14일간 배양한 후, 배지를 50% 에탄올로 추출했습니다. 시료 60ml를 건조하여 조추출물 59.5mg을 얻었습니다. 조추출물을 역상 HPLC로 분석하여 N-메톡시-1H-피롤-2-카르복사마이드(1, 쿠마모나마이드라고 함, 36.0mg)를 얻었습니다. 1의 총량은 조추출물의 약 60%입니다. 따라서 본 연구에서는 쿠마모나마이드 1의 특성을 자세히 연구하기로 했습니다.
쿠마몬아마이드 1은 흰색 비정질 분말이며, 고분해능 질량 분석법(HRESIMS)으로 C6H8N2O2를 확인했습니다(그림 1). 이 화합물의 C2-치환 피롤 단편은 δH 6.94(1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78(1H, d, J = 2.5, 1H NMR 스펙트럼에서 δH: 4.5 Hz, H-5) 및 δH 6.78(1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)을 나타내며, 13C NMR 스펙트럼은 sp2 탄소 원자 4개의 존재를 보여줍니다. C2 위치에 아미드기가 존재하는지는 δC 161.1에서 C-3 양성자로부터 아미드 카르보닐 탄소까지의 HMBC 상관 분석을 통해 평가했습니다. 또한, δH 4.10(3H, S)과 δC 68.3에서 1H 및 13C NMR 피크는 분자 내 N-메톡시기의 존재를 나타냅니다. 메톡시기의 정확한 위치는 증강차분광법이나 핵 오버하우저법(NOEDF)과 같은 분광학적 분석을 통해 아직 결정되지 않았지만, N-메톡시-1H-피롤-2-카르복사미드가 첫 번째 후보 화합물로 선정되었습니다.
1의 정확한 구조를 결정하기 위해 전체 합성을 수행했습니다(그림 2a). 시판되는 2-아미노피리딘 2를 m-CPBA로 처리하면 정량적 수율로 해당 N-옥사이드 3이 생성되었습니다. 2의 2-아미노아지드화 후, Abramovich가 설명한 사이클로축합 반응을 90°C의 벤젠에서 수행하여 원하는 1-하이드록시-1H-피롤-2-카보니트릴 5를 그램 단위로 얻었습니다. 속도 60%(2단계). 15,16. 그런 다음 4를 메틸화하고 가수분해하여 1-메톡시-1H-피롤-2-카복실산("쿠모톤산"이라고 함, 6)을 좋은 수율(70%, 2단계)로 생성했습니다. 마지막으로, 수성 암모니아를 사용하여 산 염화물 중간체 6을 통한 아미드화로 98% 수율로 쿠마모토 아미드 1을 생성했습니다. 합성된 1의 모든 스펙트럼 데이터는 분리된 1과 유사했으므로 1의 구조가 결정되었습니다.
우르베나마이드와 우르벤산의 생물학적 활성에 대한 일반 합성 및 분석. (a) 쿠마모토 아마이드의 완전 합성. (b) 7일령 야생형 아라비돕시스 컬럼비아(Col) 유묘를 쿠마모나마이드 6 또는 쿠마모나마이드 1을 표시된 농도로 함유한 무라시게 및 스쿠그(MS) 배지에서 배양하였다. 스케일 바 = 1cm.
먼저, 우르베나마이드와 그 중간체들의 생물학적 활성이 식물 생장을 조절하는 능력을 평가했습니다. 다양한 농도의 우르스모나마이드 1 또는 우르스몬산 6를 MS 한천 배지에 첨가하고 애기장대 유묘를 이 배지에서 배양했습니다. 이 분석 결과, 고농도(500 μM)의 우르스모나마이드 6가 뿌리 생장을 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 2b). 다음으로, 우르스모나마이드 6의 N1 위치를 치환하여 다양한 유도체를 생성하고, 이들에 대한 구조-활성 관계 연구를 수행했습니다(유사체 합성 과정은 보충 자료(SI)에 설명되어 있습니다). 애기장대 유묘를 50 μM 우르스모나마이드 유도체가 포함된 배지에서 배양하고, 그림과 같이 뿌리 길이를 측정했습니다. 그림 3a, b, S1에서 볼 수 있듯이, 쿠마모산은 N1 위치에 다양한 길이의 선형 알콕시 사슬(9, 10, 11, 12, 13) 또는 긴 알콕시 사슬(15, 16, 17)을 가지고 있습니다. 이러한 유도체들은 뿌리 생장을 유의미하게 억제했습니다. 또한, 200 μM의 10, 11, 또는 17을 처리했을 때 발아가 억제되는 것을 확인했습니다(그림 3c 및 S2).
쿠마모토 아마이드 및 관련 화합물의 구조-활성 관계에 대한 연구. (a) 유사체의 구조 및 합성 도식. (b) 50 μM 쿠마몬아마이드 유도체를 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 생육한 7일령 유묘의 뿌리 길이 정량화. 별표는 모의 처리군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p 검정).< 0.05).n>18. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시했습니다. nt는 종자의 50% 이상이 발아하지 않았으므로 "검정하지 않음"을 의미합니다. (c) 200 μM 쿠마몬아마이드 및 관련 화합물을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 7일 동안 배양한 처리 종자의 발아율을 정량화했습니다. 별표는 모의 처리(카이제곱 검정)와 유의미한 차이를 나타냅니다. n=96.
흥미롭게도, C9보다 긴 알킬 측쇄를 추가하면 저해 활성이 감소하는데, 이는 쿠마모토산 관련 화합물이 생물학적 활성을 나타내려면 특정 크기의 측쇄가 필요하다는 것을 시사합니다.
구조-활성 관계 분석 결과, C9가 우르손산으로 변형되었고, 우르손산의 노닐옥시 유도체(이하 KAND 11)가 가장 효과적인 식물 생장 억제제임을 확인하여 KAND 11에 대한 더욱 상세한 특성 분석을 수행했습니다. 50 μM의 KAND 11을 아라비돕시스에 처리했을 때 발아가 거의 완전히 억제되었지만, 저농도(40, 30, 20 또는 10 μM)의 KAND 11은 용량 의존적으로 뿌리 생장을 억제했습니다(그림 4a, b). KAND 11이 뿌리 분열조직의 생존력에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 프로피듐 요오드화물(PI)로 염색한 뿌리 분열조직을 검사하고 분열조직 면적을 측정했습니다. 25 μM KAND-11을 함유한 배지에서 자란 묘목의 분열조직 크기는 151.1 ± 32.5 μm인 반면, DMSO를 함유한 대조 배지에서 자란 묘목의 분열조직 크기는 264.7 ± 30.8 μm였습니다(그림 4c, d). 이는 KAND-11이 세포 활동을 회복시킴을 시사합니다. 뿌리 분열조직. 이와 일치하게, KAND 11 처리는 뿌리 분열조직에서 세포 분열 마커인 CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS 신호의 양을 감소시켰습니다(그림 4e) 17. 이러한 결과는 KAND 11이 세포 증식 활동을 감소시켜 뿌리 성장을 억제함을 시사합니다.
우르베논산 유도체(우르베닐옥시 유도체)의 생장 억제 효과 분석. (a) 표시된 농도의 KAND 11을 첨가한 MS 평판 배지에서 자란 7일령 야생형 Col 유묘. 스케일 바 = 1cm. (b) 뿌리 길이 정량화. 문자는 유의미한 차이를 나타냄(Tukey HSD 검정, p< 0.05).n>16. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시했습니다. (c) 25 μM KAND 11을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 플레이트에서 배양한 프로피듐 요오드 염색 야생형 Col 뿌리의 공초점 현미경 사진입니다. 흰색 괄호는 뿌리 분열조직을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. (d) 뿌리 분열조직 크기 정량화(n = 10~11). 통계적 차이는 t-검정(p< 0.05). 막대는 평균 분열조직 크기를 나타낸다. (e) CDKB2 구조를 포함하는 뿌리 분열조직의 차등 간섭 대조(DIC) 현미경; 1pro: CDKB2; 1-GUS 염색 및 25 µM KAND 분석이 있거나 없는 MS 플레이트에서 자란 5일 된 묘목에서 염색.
KAND 11의 식물독성은 다른 쌍떡잎식물인 담배(Nicotiana tabacum)와 주요 육상 식물 모델 생물인 우산이끼(Marchantia polymorpha)를 사용하여 추가로 시험했습니다. 애기장대와 마찬가지로, 25 μM KAND 11이 포함된 배지에서 자란 담배 SR-1 유묘는 뿌리가 더 짧았습니다(그림 5a). 또한, 200 μM KAND 11이 포함된 배지에서는 48개의 씨앗 중 40개가 발아한 반면, 모의 처리 배지에서는 48개의 씨앗 모두가 발아하여 KAND 농도가 높을수록 유의미함을 나타냈습니다(p< 0.05; 카이 검정 -제곱)은 담배의 발아를 억제했습니다(그림 5b). 또한, 우산이끼에서 박테리아 성장을 억제하는 KAND 11의 농도는 애기장대에서 유효 농도와 유사했습니다(그림 5c). 이러한 결과는 KAND 11이 다양한 식물의 성장을 억제할 수 있음을 시사합니다. 이어서, 고등 동물 세포와 박테리아 세포를 대표하는 인간 HeLa 세포와 대장균 DH5α 균주를 포함한 다른 생물체에서 곰 모노아마이드 관련 화합물의 세포독성 가능성을 조사했습니다. 일련의 세포 증식 분석에서, 쿠마모나마이드 1, 쿠마모나마이드산 6, 그리고 KAND 11은 100 μM 농도에서 HeLa 세포나 대장균 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다(그림 5d, e).
비애기장대 생물에서 KAND 11의 성장 억제. (a) 2주령 야생형 SR-1 담배 묘목을 25 μM KAND 11이 포함된 수직 MS 플레이트에서 배양했습니다. (b) 2주령 야생형 SR-1 담배 묘목을 200 μM KAND 11이 포함된 수평 MS 플레이트에서 배양했습니다. (c) 표시된 농도의 KAND 11이 포함된 Gamborg B5 플레이트에서 배양한 2주령 야생형 Tak-1 우산이끼 싹. 빨간색 화살표는 2주 배양 기간 내에 성장을 멈춘 포자를 나타냅니다. (d) HeLa 세포의 세포 증식 분석. 생존 가능한 세포의 수는 세포 계수 키트 8(Dojindo)을 사용하여 고정된 시간 간격으로 측정했습니다. 대조군으로 HeLa 세포에 RNA 중합효소 전사를 억제하고 세포 사멸을 유발하는 5 μg/ml 액티노마이신 D(Act D)를 처리했습니다. 분석은 3회 반복하여 수행되었다. (e) 대장균 세포 증식 분석. 대장균 증식은 OD600을 측정하여 분석하였다. 대조군으로, 세포벽 합성을 억제하는 암피실린(Amp) 50 μg/ml을 처리하였다. 분석은 3회 반복하여 수행되었다.
우라마이드 관련 화합물에 의한 세포독성의 작용 기전을 밝히기 위해, 중간 정도의 억제 효과를 나타내는 우르벤산 유도체를 재분석하였다.그림 2b, 6a에서 볼 수 있듯이, 고농도(200 μM)의 우르모톤산 6을 함유한 한천 배지에서 자란 묘목은 뿌리가 짧고 왼쪽으로 휘어진 형태(θ = – 23.7 ± 6.1)를 보였고, 대조 배지에서 자란 묘목은 거의 곧은 뿌리(θ = – 3.8 ± 7.1)를 보였다. 이러한 특징적인 사선 생장은 피질 미세소관의 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다14,18. 이러한 결과와 일치하게, 미세소관 불안정화 약물인 디소피라미드와 오리잘린은 본 생장 조건에서 유사한 뿌리 기울기를 유도하였다(그림 2b, 6a). 동시에, 우르모톤산 유도체들을 시험하고, 특정 농도에서 사선 뿌리 생장을 유도하는 몇몇 유도체들을 선별했습니다. 화합물 8, 9, 15는 각각 75 μM, 50 μM, 40 μM에서 뿌리 생장 방향을 변화시켜, 이 화합물들이 미세소관을 효과적으로 불안정화할 수 있음을 시사했습니다(그림 2b, 6a). 또한, 가장 강력한 우르솔산 유도체인 KAND 11을 더 낮은 농도(15 μM)에서 시험한 결과, KAND 11 처리가 뿌리 생장을 억제하고 뿌리 생장 방향이 고르지 않았지만, 왼쪽으로 기울어지는 경향을 보였습니다(그림 C3). 미세소관 불안정화 약물의 농도가 높을수록 뿌리 기울기를 유발하기보다는 식물 생장을 억제하는 경우가 있으므로, 뿌리 표피 세포의 피질 미세소관을 관찰하여 KAND 11이 미세소관에 영향을 미칠 가능성을 평가했습니다. 25 μM KAND 11로 처리한 묘목 뿌리의 표피 세포에서 항-β-튜불린 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과, 신장 영역에서 표피 세포의 거의 모든 피질 미세소관이 소실됨을 확인했습니다(그림 6b). 이러한 결과는 쿠마모토닉산과 그 유도체가 미세소관에 직접 또는 간접적으로 작용하여 미세소관을 파괴하며, 이 화합물들이 새로운 미세소관 억제제임을 시사합니다.
우르손산과 그 유도체는 애기장대의 피질 미세소관을 변화시킨다. (a) 다양한 우르손산 유도체를 특정 농도로 첨가하여 측정한 뿌리 경사각. 미세소관 억제 효과가 있는 것으로 알려진 두 가지 화합물인 디소피라미드와 오리잘린의 효과도 분석하였다. 삽도는 뿌리 생장각 측정에 사용되는 표준을 보여준다. 별표는 모의 처리군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p 검정).< 0.05).n>19. 스케일 바 = 1cm. (b) 신장대 상피세포의 피질 미세소관. 25 μM KAND 11을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 플레이트에서 배양한 야생형 애기장대 Col 뿌리의 미세소관은 β-튜불린 일차 항체와 Alexa Fluor-접합 이차 항체를 이용한 면역조직화학 염색으로 시각화하였다. 스케일 바 = 10 μm. (c) 뿌리 분열조직 내 미세소관의 유사분열 구조. 미세소관은 면역조직화학 염색을 통해 시각화하였다. 전기대, 방추체, 격막체를 포함한 유사분열 구조는 공초점 이미지에서 계수하였다. 화살표는 유사분열 미세소관 구조를 나타낸다. 별표는 모의 처리군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p 검정).< 0.05).n>9. 스케일 바 = 50 µm.
Ursa는 미세소관 기능을 저해하는 능력이 있지만, 그 작용 기전은 일반적인 미세소관 탈중합제와는 다를 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 디소피라미드와 오리잘린과 같은 미세소관 탈중합제를 고농도로 처리하면 표피 세포의 이방성 확장을 유도하는 반면, KAND 11은 그렇지 않습니다. 또한, KAND 11과 디소피라미드를 병용 투여했을 때 디소피라미드 유도 뿌리 생장 반응과 KAND 11 유도 생장 억제가 동시에 나타났습니다(그림 S4). 또한, 과민성 디소피라미드 1-1(phs1-1) 돌연변이체의 KAND 11에 대한 반응을 분석했습니다. phs1-1은 비정형적인 튜불린 키나제 점 돌연변이를 가지고 있으며, 디소피라미드로 처리했을 때 뿌리가 짧아졌습니다9,20. KAND 11이 포함된 한천 배지에서 자란 phs1-1 돌연변이체 묘목은 디소피라미드 배지에서 자란 묘목과 유사하게 뿌리가 짧았습니다(그림 S5).
또한, KAND 11을 처리한 묘목의 뿌리 분열 조직에서 전기대, 방추체, 프라그모플라스트와 같은 체세포 분열 미세소관 구조를 관찰했습니다. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS의 관찰 결과와 일치하게, 체세포 분열 미세소관의 수가 현저히 감소했습니다(그림 6c).
세포 내 분해능에서 KAND 11의 세포독성을 특성화하기 위해 담배 BY-2 현탁 세포에 KAND 11을 처리하고 반응을 관찰했습니다. 먼저 미세소관을 형광으로 표시하는 TagRFP-TUA6를 발현하는 BY-2 세포에 KAND 11을 첨가하여 KAND 11이 피질 미세소관에 미치는 영향을 평가했습니다. 피질 미세소관 밀도는 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 백분율을 정량화하는 이미지 분석을 사용하여 평가했습니다. 분석 결과, 50 μM 또는 100 μM KAND 11로 1시간 처리한 후 밀도가 각각 0.94 ± 0.74% 또는 0.23 ± 0.28%로 크게 감소한 반면 DMSO로 처리한 세포의 밀도는 1.61 ± 0.34%였습니다(그림 7a). 이러한 결과는 KAND 11 처리가 피질 미세소관의 탈중합을 유도한다는 Arabidopsis의 관찰과 일치합니다(그림 6b). 또한 동일한 농도의 KAND 11로 처리한 후 GFP-ABD로 표지된 액틴 필라멘트가 있는 BY-2 라인을 조사한 결과 KAND 11 처리가 액틴 필라멘트를 파괴하는 것을 관찰했습니다. 50 μM 또는 100 μM KAND 11로 1시간 처리하면 액틴 필라멘트 밀도가 각각 1.20 ± 0.62% 또는 0.61 ± 0.26%로 크게 감소했지만 DMSO로 처리한 세포의 밀도는 1.69 ± 0.51%였습니다(그림 2). 7b). 이러한 결과는 액틴 필라멘트에 영향을 미치지 않는 프로피자마이드와 미세소관에 영향을 미치지 않는 액틴 탈중합제인 라트룬쿨린 B의 효과와 대조됩니다(SI 그림 S6). 또한, 쿠마모나마이드 1, 쿠마모나마이드산 6 또는 KAND 11 처리는 HeLa 세포의 미세소관에 영향을 미치지 않았습니다(SI 그림 S7). 따라서 KAND 11의 작용 기전은 알려진 세포골격 교란 물질의 작용 기전과 다른 것으로 여겨집니다. 또한, KAND 11로 처리한 BY-2 세포에 대한 현미경 관찰 결과, KAND 11 처리 중 세포 사멸이 시작되었으며, 에반스 블루 염색된 사멸 세포의 비율이 KAND 11 처리 30분 후에 유의미하게 증가하지 않았지만, 50 μM 또는 100 μM KAND로 90분 처리한 후에는 사멸 세포의 수가 각각 43.7% 또는 80.1%로 증가했습니다(그림 7c). 이러한 데이터를 종합해 보면, 새로운 우르솔산 유도체인 KAND 11이 이전에 알려지지 않은 작용 기전을 가진 식물 특이적 세포골격 억제제임을 알 수 있습니다.
KAND는 담배 BY-2 세포의 피질 미세소관, 액틴 필라멘트 및 생존력에 영향을 미칩니다. (a) TagRFP-TUA6 존재 하에서 BY-2 세포의 피질 미세소관을 시각화한 결과입니다. KAND 11(50 μM 또는 100 μM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 관찰했습니다. 피질 미세소관 밀도는 25개의 독립된 세포의 현미경 사진으로부터 계산했습니다. 문자는 유의미한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 검정, p< 0.05). 스케일 바 = 10 µm. (b) GFP-ABD2 존재 하에서 시각화된 BY-2 세포의 피질 액틴 필라멘트. KAND 11(50 μM 또는 100 μM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 관찰했습니다. 피질 액틴 필라멘트의 밀도는 25개의 독립적인 세포의 현미경 사진으로부터 계산했습니다. 문자는 유의미한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 검정, p< 0.05). 스케일 바 = 10 µm. (c) 에반스 블루 염색을 통한 죽은 BY-2 세포 관찰. KAND 11(50 µM 또는 100 µM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 명시야 현미경으로 관찰. n=3. 스케일 바 = 100 µm.
새로운 천연물의 발견과 응용은 의학과 농업을 포함한 인간 삶의 다양한 측면에서 상당한 발전을 가져왔습니다. 천연자원에서 유용한 화합물을 얻기 위한 역사적 연구가 수행되어 왔습니다. 특히, 방선균은 이버멕틴과 블레오마이신의 주요 화합물인 아베르멕틴 및 그 유도체와 같은 다양한 이차 대사산물을 생성할 수 있기 때문에 선충류에 대한 항기생충 항생제로 유용한 것으로 알려져 있습니다. 아베르멕틴은 항암제로 사용되는 21,22 약물입니다. 마찬가지로, 방선균에서 다양한 제초 화합물이 발견되었으며, 그중 일부는 이미 상업적으로 사용되고 있습니다.1,23 따라서 원하는 생물학적 활성을 가진 천연물을 분리하기 위한 방선균 대사산물 분석은 효과적인 전략으로 간주됩니다. 본 연구에서는 S. werraensis로부터 새로운 화합물인 쿠마모나마이드를 발견하고 성공적으로 합성했습니다. 우르손산은 우르베나마이드와 그 유도체의 합성 중간체입니다. KAND 11은 특징적인 뿌리 말림을 유발하고, 중간 정도에서 강한 제초 활성을 나타내며, 식물 미세소관에 직간접적인 손상을 입힐 수 있습니다. 그러나 우르모톤산의 작용 기전은 기존 미세소관 억제제와 다를 수 있는데, KAND 11은 액틴 필라멘트를 파괴하고 세포 사멸을 유발하기 때문입니다. 이는 우르모톤산과 그 유도체가 광범위한 세포골격 구조에 영향을 미치는 조절 기전을 시사합니다.
우르베논산의 더욱 상세한 특성 분석은 우르베논산의 작용 기전을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, 다음 목표는 우르소닉산이 환원된 미세소관에 결합하는 능력을 평가하여 우르소닉산과 그 유도체가 미세소관에 직접 작용하여 분해하는지, 아니면 미세소관을 불안정화시키는지 확인하는 것입니다. 또한, 미세소관이 직접적인 표적이 아닌 경우, 식물 세포에서 우르소닉산의 작용 부위와 분자 표적을 파악하면 관련 화합물의 특성과 제초 활성을 향상시킬 수 있는 방법을 더욱 깊이 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 본 연구에서는 애기장대, 담배, 우산이끼와 같은 식물의 생장에 우르소닉산이 갖는 독특한 세포독성 능력을 확인했으며, 대장균이나 HeLa 세포에는 영향을 미치지 않았습니다. 동물 세포에 대한 독성이 거의 없거나 전혀 없다는 점은 우르소닉산 유도체가 개방형 농경지용 제초제로 개발될 경우 큰 장점입니다. 실제로 미세소관은 진핵생물에서 흔한 구조이기 때문에 식물에서의 선택적 저해는 제초제의 핵심 요건입니다. 예를 들어, 튜불린에 직접 결합하여 중합을 억제하는 미세소관 탈중합제인 프로피자마이드는 동물 세포에 대한 독성이 낮아 제초제로 사용됩니다.24 디소피라미드와 달리, 관련 벤자마이드는 다른 표적 특이성을 가지고 있습니다. 식물 미세소관 외에도 RH-4032 또는 벤족사마이드는 각각 동물 세포 또는 난균류의 미세소관을 저해하며, 잘릴라마이드는 낮은 식물 독성으로 인해 살균제로 사용됩니다.25,26,27 새롭게 발견된 곰팡내와 그 유도체는 식물에 대한 선택적 세포독성을 나타내지만, 추가적인 변형을 통해 표적 특이성을 변화시켜 병원성 진균 또는 난균류 방제를 위한 추가적인 유도체를 제공할 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다.
우르베논산과 그 유도체의 독특한 특성은 제초제 개발 및 연구 도구로서의 활용에 유용합니다. 식물 세포 형태 조절에 있어 세포골격의 중요성은 널리 알려져 있습니다. 이전 연구에서는 식물이 형태형성을 적절히 조절하기 위해 미세소관 역학을 조절함으로써 복잡한 피질 미세소관 조직화 기전을 발전시켜 왔음을 보여주었습니다. 미세소관 활성 조절에 관여하는 수많은 분자들이 확인되었으며, 관련 연구는 여전히 진행 중입니다3,4,28. 식물 세포 내 미세소관 역학에 대한 현재의 이해는 피질 미세소관 조직화 기전을 완전히 설명하지 못합니다. 예를 들어, 디소피라미드와 오리잘린은 모두 미세소관을 탈중합시킬 수 있지만, 디소피라미드는 심각한 뿌리 변형을 유발하는 반면, 오리잘린은 비교적 약한 효과를 나타냅니다. 더욱이, 미세소관을 안정화시키는 튜불린의 돌연변이는 뿌리의 우회전을 유발하는 반면, 미세소관 역학을 안정화시키는 파클리탁셀은 그렇지 않습니다. 따라서 우르솔산의 분자 표적을 연구하고 규명하는 것은 식물 피질 미세소관 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다. 마찬가지로, 디소피라미드와 같이 왜곡된 생장을 촉진하는 데 효과적인 화학물질과 오리잘린이나 쿠마모토산과 같이 효과가 덜한 화학물질을 비교하는 향후 연구를 통해 왜곡된 생장이 어떻게 발생하는지에 대한 단서를 제공할 것입니다.
한편, 방어 관련 세포골격 재배열은 우르손산의 세포독성을 설명하는 또 다른 가능성입니다. 병원균의 감염이나 식물 세포 내 유도물질의 도입은 때때로 세포골격의 파괴와 그에 따른 세포 사멸을 유발합니다29. 예를 들어, 난균류 유래 크립토잔틴은 담배 세포 사멸 전에 미세소관과 액틴 필라멘트를 파괴하는 것으로 보고되었으며, 이는 KAND 처리에서 발생하는 것과 유사합니다30,31. 우르손산에 의해 유도되는 세포 반응과 방어 반응 사이의 유사성은 이들이 일반적인 세포 과정을 유발한다는 가설을 세우게 했지만, 크립토잔틴보다 우르손산의 효과가 더 빠르고 강력하다는 것은 분명합니다. 그러나 연구에 따르면 액틴 필라멘트의 파괴는 자발적인 세포 사멸을 촉진하며, 이것이 항상 미세소관 파괴를 동반하는 것은 아닙니다29. 또한, 우르손산 유도체처럼 병원균이나 유도물질 중 어느 것이 뿌리 생장 왜곡을 유발하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 방어 반응과 세포골격을 연결하는 분자적 지식은 해결해야 할 매력적인 문제입니다. 우르손산과 관련된 저분자량 화합물과 다양한 효능을 가진 다양한 유도체의 존재를 활용함으로써, 알려지지 않은 세포 기전을 표적으로 삼을 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.
이러한 연구들을 종합해 볼 때, 미세소관 역학을 조절하는 새로운 화합물의 발견과 응용은 식물 세포 형태 결정의 근간이 되는 복잡한 분자 메커니즘을 규명하는 강력한 방법을 제공할 것입니다. 이러한 맥락에서, 미세소관과 액틴 필라멘트에 영향을 미치고 세포 사멸을 유도하는 최근 개발된 화합물 우르모톤산(urmoton acid)은 미세소관 조절과 이러한 다른 메커니즘들 사이의 연관성을 규명할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 따라서 우르베논산을 이용한 화학적 및 생물학적 분석은 식물 세포골격을 조절하는 분자적 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
S. werraensis MK493-CF1을 2% (w/v) 갈락토스, 2% (w/v) 에센스 페이스트, 1% (w/v) 박토(Bacto) 조성의 110 mL 종자 배지가 담긴 500 mL 삼각 플라스크에 접종합니다. 종자 배지는 2% (w/v) 갈락토스, 2% (w/v) 에센스 페이스트, 1% (w/v) 박토(Bacto)-소이톤(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) 옥수수 추출물(KOGOSTCH Co., Ltd., 일본), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4, 0.2% CaCO3를 탈이온수(멸균 전 pH 7.4)에 녹인 것입니다. 종자 배양액을 회전식 진탕기(180 rpm)에서 27°C, 2일 동안 배양했습니다. 생산 배양은 고체 발효를 이용했습니다. 종자 배양액(7 ml)을 압착 보리(MUSO Co., Ltd., 일본) 15 g과 탈이온수(살균 전 pH 조정 없음) 25 g으로 구성된 생산 배지 40 g이 담긴 500 ml K-1 플라스크에 옮겼다. 발효는 30°C, 암실에서 14일 동안 진행했다. 발효액을 병당 40 ml의 에탄올로 추출하고 원심분리했다(1500 g, 4°C, 10분). 배양 상층액(60 ml)을 10% 메탄올/에틸아세테이트 혼합액으로 추출했다. 유기층을 감압 하에 증발시켜 잔류물(59.5mg)을 얻었고, 이를 역상 컬럼(SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5μm, ID 10mm × 길이 250mm)에서 1.5ml/분의 유속으로 구배 용출(0~10분: 90%)을 이용한 HPLC에 적용했습니다. H2O/CH3CN, 10~35분: 90% H2O/CH3CN에서 70% H2O/CH3CN(구배), 35~45분: 90% H2O/EtOH, 45~155분: 90% H2O/EtOH에서 100% EtOH(구배(구배), 155~200분: 100% EtOH)을 적용한 결과, 쿠마모나미드(1, 36.0mg)가 흰색 비정질 분말로 분리되었습니다.
쿠마모토아미드(1); 1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 6.93(t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76(dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05(t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08(s, 3H); 13C-NMR(125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 계산값: 141.0659, 측정값: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
컬럼비아 종자(Col-0)는 아라비돕시스 생물자원센터(ABRC)에서 연구용 허가를 받아 구입했습니다. Col-0 종자는 실험실 조건에서 증식 및 관리하여 야생형 아라비돕시스 식물로 사용했습니다. 아라비돕시스 종자는 표면 살균 후, 2% 수크로오스(후지필름 와코 순약), 0.05%(w/v) 2-(4-모르폴리노)에탄설폰산(MES)(후지필름 와코 순약) 및 1.5% 아가(후지필름 와코 순약)를 함유한 반농도 무라시게 및 스쿠그 배지(pH 5.7)에서 23°C, 항광 조건에서 배양했습니다. phs1-1 돌연변이체의 종자는 나라과학기술연구소(Nara Institute of Science and Technology)의 T. 하시모토(T. Hashimoto)가 제공했습니다.
SR-1 균주의 종자는 T. Hashimoto(나라과학기술대학)에서 제공받아 야생형 담배 식물체로 사용하였다. 담배 종자는 표면 살균 후 발아 촉진을 위해 3일 동안 멸균수에 침지한 후, 2% 수크로오스, 0.05%(w/v) MES, 0.8% 겔란검(후지필름 와코 순약)을 함유한 반농도 용액(후지필름 와코 순약, 무라시게 및 스쿠그 배지)에 넣고 pH 5.7로 조절한 후 23°C, 항온 배양하였다.
Tak-1 균주는 교토대학교 T. Kohchi에서 제공되었으며, 우산이끼 연구의 표준 실험 단위로 사용되었습니다. 멸균된 배양 식물에서 Gemma를 채취하여 1% 수크로오스와 0.3% 겔란검이 함유된 Gamborg B5 배지(Fujifilm Wako Pure Chemical)에 도말하여 23°C에서 연속 광 하에 배양했습니다.
담배 BY-2 세포(Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)는 S. Hasezawa(도쿄 대학교)에서 제공받았습니다. BY-2 세포는 변형된 Linsmeier 및 Skoog 배지에서 95배 희석하고 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32를 매주 보충했습니다. 세포 현탁액은 회전식 진탕기를 사용하여 27°C, 암실에서 130 rpm으로 혼합했습니다. 세포를 10배 용량의 신선한 배지로 세척하고 동일한 배지에 재현탁했습니다. 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 하에 미세소관 마커 TagRFP-TUA6 또는 액틴 필라멘트 마커 GFP-ABD2를 안정적으로 발현하는 BY-2 형질전환 세포주는 설명된 대로 생성되었습니다33,34,35. 이러한 세포주는 원래 BY-2 세포주에 사용된 것과 유사한 절차를 사용하여 유지 및 동기화할 수 있습니다.
HeLa 세포는 10% 태아우혈청, 1.2 U/ml 페니실린, 1.2 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)(Life Technologies)에서 37°C 배양기에서 5% CO2로 배양했습니다.
본 원고에 기술된 모든 실험은 일본 생물 안전 규정 및 지침에 따라 수행되었습니다.
화합물은 디메틸 설폭사이드(DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical)를 스톡 용액으로 사용하여 용해하고, 애기장대의 경우 MS 배지, 우산이끼의 경우 담배 또는 Gamborg B5 배지에 희석했습니다. 뿌리 성장 억제 검정을 위해, 표시된 화합물 또는 DMSO가 포함된 한천 배지에 플레이트당 10개 이상의 종자를 파종했습니다. 종자를 성장 챔버에서 7일 동안 배양했습니다. 묘목을 사진으로 찍고 뿌리의 길이를 측정했습니다. 애기장대 발아 검정을 위해, 200 μM 화합물 또는 DMSO가 포함된 한천 배지에 플레이트당 48개의 종자를 파종했습니다. 애기장대 종자를 성장 챔버에서 재배하고 발아 7일 후(dag)에 발아한 묘목의 수를 세었습니다. 담배 발아 검정을 위해, 200 μM KAND 또는 DMSO가 포함된 한천 배지에 플레이트당 24개의 종자를 파종했습니다. 담배 종자를 성장 챔버에서 재배하고 14일 후에 발아한 묘목의 수를 세었습니다. 우산이끼 성장 억제 검정을 위해, 각 플레이트에서 9개의 배아를 지정된 농도의 KAND 또는 DMSO가 포함된 한천 배지에 도말하고 성장 챔버에서 14일 동안 배양했습니다.
5 mg/ml 프로피듐 요오드화물(PI)로 염색한 묘목을 사용하여 뿌리 분열조직의 구조를 시각화했습니다. PI 신호는 TCS SPE 공초점 레이저 주사 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 형광 현미경으로 관찰했습니다.
말라미와 벤페이(Malami and Benfey)가 기술한 프로토콜36에 따라 β-글루쿠로니다제(GUS)를 이용한 뿌리 조직화학 염색을 수행하였다. 묘목을 90% 아세톤에 하룻밤 고정하고, GUS 완충액에 0.5 mg/ml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-d-글루쿠론산을 첨가하여 1시간 동안 염색한 후, 수화된 클로르알데히드 용액(8 g 클로랄 수화물, 2 ml 물, 1 ml 글리세롤)에 넣고 Axio Imager M1 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 차등 간섭 현미경으로 관찰하였다.
수직으로 놓인 접시에 심은 7일 된 묘목의 뿌리 각도를 측정했습니다. 6단계에서 설명한 대로 중력 벡터 방향에서 뿌리 각도를 측정했습니다.
피질 미세소관의 배열은 프로토콜을 약간 수정하여 기술된 바와 같이 관찰했습니다. 37 항-β-튜불린 항체(KMX-1, Merk Millipore: MAB3408)와 Alexa Fluor 488-접합 항-마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A32723)를 각각 1:1000 및 1:100 희석하여 1차 및 2차 항체로 사용했습니다. 형광 이미지는 TCS SPE 공초점 레이저 주사 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 획득했습니다. Z-스택 이미지를 획득하고 제조업체의 지침에 따라 최대 강도 투영을 생성했습니다.
HeLa 세포 증식 검사는 제조사의 지침에 따라 Cell Counting Kit 8(Dojindo)을 사용하여 수행되었습니다.
E. coli DH5α의 성장은 600 nm(OD600)에서 분광광도계를 사용하여 배양액 내 세포 밀도를 측정하여 분석했습니다.
형질전환 BY-2 세포의 세포골격 조직화는 CSU-X1 공초점 스캐닝 장치(Yokogawa)와 sCMOS 카메라(Zyla, Andor Technology)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 세포골격 밀도는 이미지 분석을 통해 평가하였는데, 이는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 공초점 이미지에서 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 비율을 정량화한 것이다(38,39).
BY-2 세포에서 세포 사멸을 검출하기 위해, 세포 현탁액의 분취량을 0.05% 에반스 블루 용액과 함께 실온에서 10분간 배양했습니다. 사멸 세포의 선택적 에반스 블루 염색은 세포막이 살아있는 세포로부터 염색약을 배출하는 데 달려 있습니다40. 염색된 세포는 명시야 현미경(BX53, Olympus)을 사용하여 관찰했습니다.
HeLa 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO2 조건의 가습 배양기에서 배양했습니다. 세포에 100 μM KAND 11, 쿠마모남산 6, 쿠마모나마이드 1, 100 ng/ml 콜세미드(Gibco) 또는 100 ng/ml 노코드메이즈(Sigma)를 37°C에서 6시간 동안 처리했습니다. 세포를 메탄올(MetOH)로 10분 동안 고정한 후, 아세트산으로 5분 동안 실온에서 고정했습니다. 고정된 세포를 0.5% BSA/PBS에 희석한 β-튜불린 일차 항체(1D4A4, Proteintech: 66240-1)와 2시간 동안 배양하고, TBST로 3회 세척한 후 Alexa Fluor 염소 항체와 함께 배양했습니다. 488 1시간. – 마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A11001)와 15 ng/ml 4′,6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 0.5% BSA/PBS에 희석하여 사용하였다. TBST로 세 번 세척한 후, 염색된 세포를 Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경으로 관찰하였다. 이미지는 냉각된 Hamamatsu ORCA-R2 CCD 카메라와 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하여 촬영하였다.
게시 시간: 2024년 6월 17일