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천연물의 발견과 유익한 활용은 인간의 삶을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.식물 성장 억제 화학물질은 잡초를 방제하기 위한 제초제로 널리 사용됩니다.다양한 유형의 제초제를 사용해야 하기 때문에 새로운 작용 메커니즘을 가진 화합물을 식별할 필요가 있습니다.본 연구에서는 Streptomyces werraensis MK493-CF1에서 새로운 N-alkoxypyrrole 화합물인 coumamonamide를 발견하고 완전한 합성 과정을 확립했습니다.생물학적 활성 분석을 통해 우리는 urs-모노아믹산이 urs-모노아미드의 합성 중간체이며 잠재적인 가능성이 있음을 발견했습니다.식물 성장 억제제.또한, HeLa 세포의 성장에 부정적인 영향을 주지 않으면서 높은 제초 활성을 갖는 우르베닐옥시 유도체(UDA)를 비롯한 다양한 우르베논산 유도체를 개발했습니다.우리는 또한 우르모토산 유도체가 식물 미세소관을 파괴한다는 사실도 발견했습니다.또한 KAND는 액틴 필라멘트에 영향을 미치고 세포 사멸을 유도합니다.이러한 다각적인 효과는 알려진 미세소관 억제제의 효과와 다르며 우르소닉산에 대한 새로운 작용 메커니즘을 제시하며 이는 새로운 제초제 개발에 중요한 이점을 나타냅니다.
유익한 천연물과 그 파생물의 발견과 실용화는 인간 삶의 질을 향상시키는 수단입니다.미생물, 식물, 곤충에 의해 생산된 2차 대사산물은 의학과 농업 분야에서 큰 발전을 가져왔습니다.많은 항생제와 항백혈병 약물이 천연물에서 개발되었습니다.그 밖에도 다양한 종류의살충제, 살균제와 제초제는 농업에 사용하기 위해 이러한 천연물에서 추출됩니다.특히, 잡초 방제 제초제는 현대 농업에서 작물 수확량을 늘리는 중요한 도구이며, 이미 다양한 유형의 화합물이 상업적으로 사용되고 있습니다.광합성, 아미노산 대사, 세포벽 합성, 유사분열 조절, 식물호르몬 신호 전달 또는 단백질 합성과 같은 식물의 여러 세포 과정은 제초제의 전형적인 표적으로 간주됩니다.미세소관 기능을 억제하는 화합물은 유사분열 조절에 영향을 주어 식물 성장에 영향을 미치는 일반적인 종류의 제초제입니다.
미세소관은 세포골격의 구성 요소이며 진핵 세포에서 널리 보존됩니다.튜불린 이종이량체는 선형 미세소관 원형필라멘트를 형성하는 α-튜불린과 β-튜불린으로 구성되며, 13개의 원형필라멘트가 원통형 구조를 형성합니다.미세소관은 세포 모양 결정, 세포 분열 및 세포내 수송을 포함하여 식물 세포에서 다양한 역할을 합니다3,4.식물 세포는 간기 원형질막 아래에 미세소관을 포함하고 있으며 이러한 소위 피질 미세소관은 셀룰로오스 합성효소 복합체의 조절을 통해 셀룰로오스 미세섬유의 구성을 제어하는 것으로 생각됩니다4,5.뿌리 끝의 급속 신장 영역에 존재하는 뿌리 표피 세포의 피질 미세소관은 측면에 위치하며, 셀룰로오스 미세섬유는 이러한 미세소관을 따라가며 세포 확장 방향을 제한하여 이방성 세포 신장을 촉진합니다.따라서 미세소관 기능은 식물 형태와 밀접한 관련이 있습니다.튜불린을 코딩하는 유전자의 아미노산 치환은 대뇌피질 미세소관 배열의 왜곡과 Arabidopsis의 왼쪽 또는 오른쪽 성장을 유발합니다 6,7.마찬가지로, 미세소관 역학을 조절하는 미세소관 관련 단백질의 돌연변이는 뿌리 성장의 왜곡을 초래할 수도 있습니다8,9,10,11,12,13.또한, 프레틸라클로르라고도 알려진 디소피라미드와 같은 미세소관 교란 제초제로 처리하면 왼쪽 경사 뿌리 성장이 발생합니다14.이러한 데이터는 미세소관 기능의 정확한 조절이 식물 성장 방향을 결정하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다.
다양한 유형의 미세소관 억제제가 발견되었으며, 이러한 약물은 세포골격 연구는 물론 농업 및 의학에 상당한 기여를 했습니다2.특히, 오리잘린, 디니트로아닐린 화합물, 디소피라미드, 벤즈아미드 관련 화합물 및 이들의 유사체는 미세소관 기능을 억제하여 식물 성장을 억제할 수 있습니다.따라서 제초제로 널리 사용됩니다.그러나 미세소관은 식물과 동물 세포의 중요한 구성요소이기 때문에 대부분의 미세소관 억제제는 두 세포 유형 모두에 세포독성을 나타냅니다.따라서 제초제로서의 유용성이 인정됨에도 불구하고 실제 목적으로 사용되는 항미소관제는 제한된 수입니다.
스트렙토미세스(Streptomyces)는 스트렙토마이세스(Streptomyces)과의 속으로 호기성, 그람 양성, 사상균을 포함하며 광범위한 2차 대사산물을 생산하는 능력으로 널리 알려져 있습니다.따라서 이는 새로운 생물학적 활성 천연물의 가장 중요한 공급원 중 하나로 간주됩니다.이번 연구에서는 Streptomyces werraensis MK493-CF1과 S. werraensis ISP 5486에서 분리된 coumamonamide라는 새로운 화합물을 발견했습니다. 스펙트럼 분석과 전체 스펙트럼 분석을 통해 coumamonamide의 구조를 규명하고 독특한 N-alkoxypyrrole 골격을 규명했습니다. 결정되었습니다.합성.우르스모노아미드와 그 유도체의 합성 중간체인 우르스몬산은 인기 있는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 성장과 발아를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다.구조-활성 관계 연구에서 우리는 우르소닉산의 노닐옥시 유도체(KAND)라고 불리는 우르소닉산으로 변형된 C9를 갖는 화합물이 성장 및 발아에 대한 억제 효과를 크게 향상시키는 것을 발견했습니다.특히 새로 발견된 식물 성장 억제제는 담배와 우산이끼의 성장에도 영향을 미쳤으며 박테리아나 HeLa 세포에 세포독성을 나타내지 않았습니다.더욱이, 일부 우르모토산 유도체는 왜곡된 뿌리 표현형을 유도하는데, 이는 이들 유도체가 미세소관에 직간접적으로 영향을 미친다는 것을 의미합니다.이 아이디어와 일치하여 면역조직화학적으로 또는 형광 단백질로 표지된 미세소관에 대한 우리의 관찰은 KAND 치료가 미세소관을 해중합한다는 것을 나타냅니다.또한, 쿠마모토산 유도체 처리는 액틴 미세섬유를 파괴했습니다.따라서, 우리는 독특한 작용 메커니즘이 세포골격 파괴와 관련된 새로운 식물 성장 억제제를 발견했습니다.
MK493-CF1 균주는 도쿄 시나가와구의 토양에서 분리되었습니다.MK493-CF1 균주는 잘 분지된 간질 균사체를 형성했습니다.16S 리보솜 RNA 유전자(1422bp)의 부분 서열이 결정되었습니다.이 균주는 S. werraensis(NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: 일반 균주, 99.93%)와 매우 유사합니다.이러한 결과를 토대로 본 균주는 S. werraensis의 기준균주와 밀접한 관련이 있는 것으로 판단되었다.따라서 우리는 이 균주를 S. werraensis MK493-CF1로 임시 명명했습니다.S. werraensis ISP 5486T도 동일한 생리활성 화합물을 생산합니다.이 미생물로부터 천연물을 얻는 초기 연구는 거의 없었기 때문에 추가적인 화학 연구가 진행되었습니다.S. werraensis MK493-CF1을 보리배지에서 30℃에서 14일 동안 고체발효로 배양한 후 50% EtOH로 추출하였다.60ml의 시료를 건조하여 59.5mg의 조추출물을 얻었다.조 추출물을 역상 HPLC로 처리하여 N-메톡시-1H-피롤-2-카르복스아미드(1, 쿠마몬아미드로 명명, 36.0mg)를 얻었다.1의 총량은 조추출물의 약 60%이다.따라서 우리는 쿠마모토아미드 1의 특성을 자세히 연구하기로 결정했습니다.
Coumamonamide 1은 백색 무정형 분말이며 고분해능 질량 분석법(HRESIMS)으로 C6H8N2O2를 확인했습니다(그림 1).이 화합물의 C2 치환 피롤 단편은 δH 6.94(1H, t, J = 2.8, 4.8Hz, H-4), δH 6.78(1H, d, J = 2.5, 1H NMR 스펙트럼에서 δH: 4.5Hz)을 특징으로 합니다. , H-5) 및 δH 6.78(1H, d, J = 2.5Hz, H-6)이며, 13C NMR 스펙트럼은 4개의 sp2 탄소 원자의 존재를 보여줍니다.C2 위치에 아미드기의 존재는 C-3 양성자와 δC 161.1의 아미드 카르보닐 탄소 사이의 HMBC 상관관계에 의해 평가되었습니다.또한, δH 4.10(3H, S) 및 δC 68.3에서의 1H 및 13C NMR 피크는 분자 내에 N-메톡시 그룹이 존재함을 나타냅니다.향상된 차이 분광법 및 핵 오버하우저 약어(NOEDF)와 같은 분광학 분석을 사용하여 메톡시기의 정확한 위치가 아직 결정되지 않았지만 N-메톡시-1H-피롤-2-카르복사미드가 첫 번째 후보 화합물이 되었습니다.
1의 정확한 구조를 결정하기 위해 전체 합성이 수행되었습니다 (그림 2a).상업적으로 이용 가능한 2-아미노피리딘 2를 m-CPBA로 처리하면 상응하는 N-산화물 3이 정량적 수율로 생성되었습니다.2의 2-아미노아지드화 후, Abramovich가 설명한 고리축합 반응은 90°C의 벤젠에서 수행되어 원하는 1-히드록시-1H-피롤-2-카르보니트릴 5를 그램 단위로 얻었습니다.속도 60%(2단계).15,16.4의 메틸화 및 가수분해는 1-메톡시-1H-피롤-2-카르복실산("큐모톤산"으로 명명, 6)을 양호한 수율(70%, 2단계)로 제공했습니다.마지막으로, 암모니아수를 사용하여 산 염화물 중간체 6을 통한 아미드화로 구마모토 아미드 1을 98% 수율로 얻었습니다.합성된 1의 모든 스펙트럼 데이터는 분리된 1과 유사하므로 1의 구조가 결정되었습니다.
우르벤아미드와 우르벤산의 생물학적 활성에 대한 일반적인 합성 및 분석.(a) 구마모토 아미드의 총 합성.(b) 7일된 야생형 애기장대 컬럼비아(Col) 묘목을 표시된 농도의 쿠마몬아미드 6 또는 쿠마몬아미드 1을 함유하는 Murashige 및 Skoog(MS) 플레이트에서 재배했습니다.스케일 바 = 1cm.
먼저, 우리는 식물 성장을 조절하는 능력에 대해 우르벤아미드와 그 중간체의 생물학적 활성을 평가했습니다.우리는 다양한 농도의 우르몬아미드 1 또는 우르몬산 6을 MS 한천 배지에 첨가하고 이 배지에서 애기장대 모종을 배양했습니다.이 분석은 6의 고농도(500μM)가 뿌리 성장을 억제한다는 것을 보여주었습니다(그림 2b).다음으로 N1 위치를 6으로 대체하여 다양한 파생물을 생성하고 이에 대한 구조-활성 관계 연구를 수행했습니다(아날로그 합성 과정은 지원 정보(SI)에 설명되어 있음).애기장대 묘목을 50 μM 우르소닉산 유도체가 포함된 배지에서 재배하고 뿌리 길이를 측정했습니다.그림에 표시된 것처럼.그림 3a, b 및 S1에서 볼 수 있듯이 쿠마모산은 N1 위치에 서로 다른 길이의 선형 알콕시 사슬(9, 10, 11, 12 및 13) 또는 큰 알콕시 사슬(15, 16 및 17)을 가지고 있습니다.파생물은 뿌리 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났습니다.또한 200μM 10, 11 또는 17을 적용하면 발아가 억제되는 것으로 나타났습니다(그림 3c 및 S2).
구마모토 아미드 및 관련 화합물의 구조-활성 관계 연구.(a) 유사체의 구조 및 합성 방식.(b) 50μM 쿠마몬아미드 유도체가 있거나 없는 MS 배지에서 자란 7일 된 묘목의 뿌리 길이를 정량화합니다.별표는 가짜 치료와의 유의미한 차이를 나타냅니다(t 테스트, p< 0.05).엔>18. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.nt는 씨앗의 50% 이상이 발아하지 않았기 때문에 "테스트되지 않음"을 의미합니다.(c) 200 μM 쿠마몬아미드 및 관련 화합물이 있거나 없는 MS 배지에서 7일 동안 배양된 처리된 종자의 발아율 정량화.별표는 가짜 치료(카이제곱 검정)와의 유의한 차이를 나타냅니다.n=96.
흥미롭게도 C9보다 긴 알킬 측쇄를 추가하면 억제 활성이 감소하여 쿠마모토산 관련 화합물이 생물학적 활성을 나타내려면 특정 크기의 측쇄가 필요함을 시사합니다.
구조-활성 관계 분석에서 C9가 우르소닉산으로 변형되었고 우르소닉산의 노닐옥시 유도체(이하 KAND 11)가 가장 효과적인 식물 성장 억제제인 것으로 나타났기 때문에 KAND 11의 보다 자세한 특성 분석을 수행했습니다. 50 μM KAND 11을 사용하면 발아가 거의 완전히 방지되는 반면, KAND 11의 낮은 농도(40, 30, 20 또는 10 μM)에서는 용량 의존적으로 뿌리 성장을 억제했습니다(그림 4a, b).KAND 11이 뿌리 분열조직 생존력에 영향을 미치는지 테스트하기 위해 프로피듐 요오드화물(PI)로 염색된 뿌리 분열조직을 조사하고 분열조직 면적 크기를 측정했습니다.25 μM KAND-11을 함유한 배지에서 자란 묘목의 분열조직 크기는 151.1 ± 32.5 μm인 반면, DMSO를 함유한 대조배지에서 자란 묘목의 분열조직 크기는 264.7 ± 30.8 μm였다(도 4c, d). 이는 KAND-11이 세포 활동을 복원한다는 것을 나타냅니다.확산.뿌리 분열조직.이에 맞춰 KAND 11 처리는 뿌리 분열조직에서 세포 분열 표지인 CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS 신호의 양을 감소시켰습니다(그림 4e) 17.이러한 결과는 KAND 11이 세포 증식 활성을 감소시켜 뿌리 성장을 억제한다는 것을 나타냅니다.
우르베논산 유도체(우르베닐옥시 유도체)의 성장 억제 효과 분석.(a) 표시된 농도의 KAND 11로 MS 플레이트에서 자란 7일 된 야생형 Col 묘목. 눈금 막대 = 1cm.(b) 뿌리 길이의 정량화.문자는 상당한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 테스트, p< 0.05).엔>16. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.(c) 25 μM KAND 11이 있거나 없는 MS 플레이트에서 성장한 요오드화 프로피듐으로 염색된 야생형 Col 뿌리의 공초점 현미경. 흰색 괄호는 뿌리 분열 조직을 나타냅니다.스케일 바 = 100 μm.(d) 뿌리 분열조직 크기의 정량화(n = 10~11).통계적 차이는 t-테스트를 사용하여 결정되었습니다(p< 0.05).막대는 평균 분열 조직 크기를 나타냅니다.(e) CDKB2 구성물을 포함하는 뿌리 분열 조직의 미분 간섭 대비(DIC) 현미경 검사;1프로: CDKB2;1-GUS는 25μM KAND 분석 유무에 관계없이 MS 플레이트에서 자란 5일 된 묘목에 염색 및 염색되었습니다.
KAND 11의 식물독성은 또 다른 쌍자엽 식물인 담배(Nicotiana tabacum)와 주요 육상 식물 모델 유기체인 간이끼(Marchantia polymorpha)를 사용하여 추가로 테스트되었습니다.Arabidopsis의 경우와 마찬가지로 25μM KAND 11을 함유한 배지에서 자란 담배 SR-1 묘목은 더 짧은 뿌리를 생성했습니다(그림 5a).또한, 48개 종자 중 40개는 200μM KAND 11이 포함된 플레이트에서 발아한 반면, 48개 종자 모두 모의 처리된 배지에서 발아했는데, 이는 더 높은 농도의 KAND가 유의미하다는 것을 나타냅니다(p< 0.05;chi test -square)는 담배의 발아를 억제했습니다.(그림 5b).또한 간장에서 박테리아 성장을 억제하는 KAND 11의 농도는 애기장대의 유효 농도와 유사했습니다(그림 5c).이러한 결과는 KAND 11이 다양한 식물의 성장을 억제할 수 있음을 나타냅니다.그런 다음 우리는 각각 고등 동물 및 박테리아 세포를 대표하는 인간 HeLa 세포 및 대장균 균주 DH5α와 같은 다른 유기체에서 곰 모노아미드 관련 화합물의 가능한 세포 독성을 조사했습니다.일련의 세포 증식 분석에서 우리는 coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 및 KAND 11이 100 μM 농도에서 HeLa 또는 E. coli 세포의 성장에 영향을 미치지 않음을 관찰했습니다 (그림 5d, e).
애기장대 이외의 유기체에서 KAND 11의 성장 억제.(a) 2주 된 야생형 SR-1 담배 묘목을 25 μM KAND 11이 포함된 수직 위치의 MS 플레이트에서 재배했습니다. (b) 2주 된 야생형 SR-1 담배 묘목을 수평 위치에서 재배했습니다. 200 μM KAND 11이 포함된 MS 플레이트. ( c ) 표시된 농도의 KAND 11을 사용하여 Gamborg B5 플레이트에서 자란 2주된 야생형 Tak-1 간이끼 새싹. 빨간색 화살표는 2주 배양 내에 성장이 멈춘 포자를 나타냅니다. 기간.(d) HeLa 세포의 세포 증식 분석.생존 세포 수는 세포 계수 키트 8(Dojindo)을 사용하여 일정한 시간 간격으로 측정하였다.대조군으로 HeLa 세포를 RNA 폴리머라제 전사를 억제하고 세포 사멸을 유발하는 5 μg/ml 액티노마이신 D(Act D)로 처리했습니다.분석은 3중으로 수행되었습니다.(e) 대장균 세포 증식 분석.E. coli 성장은 OD600을 측정하여 분석하였다.대조군으로서 세포를 박테리아 세포벽 합성을 억제하는 50μg/ml 암피실린(Amp)으로 처리했습니다.분석은 3회 수행되었습니다.
우라미드 관련 화합물에 의한 세포 독성 작용 메커니즘을 해독하기 위해 중간 정도의 억제 효과가 있는 우르벤산 유도체를 재분석했습니다.그림에 표시된 것처럼.그림 2b, 6a에서 볼 수 있듯이, 고농도(200μM)의 우르모토산 6을 함유한 한천 플레이트에서 자란 묘목은 더 짧고 왼쪽으로 휘어진 뿌리(θ = – 23.7 ± 6.1)를 생성한 반면, 대조 배지에서 자란 묘목은 묘목은 거의 곧은 뿌리를 생산했습니다(θ = – 3.8 ± 7.1).이러한 특징적인 경사 성장은 피질 미세소관의 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 알려져 있습니다.이 발견과 일치하여, 미세소관을 불안정하게 하는 약물인 디소피라미드와 오리잘린은 우리의 성장 조건에서 유사한 뿌리 기울어짐을 유도했습니다(그림 2b, 6a).동시에 우리는 우르모토산 유도체를 테스트하고 특정 농도에서 경사근 성장을 유도하는 여러 가지를 선택했습니다.화합물 8, 9 및 15는 각각 75 μM, 50 μM 및 40 μM에서 뿌리 성장 방향을 변경하여 이러한 화합물이 미세소관을 효과적으로 불안정화할 수 있음을 나타냅니다(그림 2b, 6a).우리는 또한 가장 강력한 우르솔산 유도체인 KAND 11을 더 낮은 농도(15μM)에서 테스트한 결과 KAND 11의 적용이 뿌리 성장을 억제하고 뿌리 성장 방향이 왼쪽으로 기울어지는 경향이 있음에도 불구하고 고르지 않다는 것을 발견했습니다. 그림 C3)..미세소관 불안정화 약물의 농도가 높을수록 뿌리 기울어짐을 유발하기보다는 식물 성장을 억제하는 경우가 있기 때문에 우리는 뿌리 표피 세포의 피질 미세소관을 관찰하여 KAND 11이 미세소관에 영향을 미칠 가능성을 평가했습니다.25μM KAND 11로 처리한 묘목 뿌리의 표피 세포에서 항-β-튜불린 항체를 사용한 면역조직화학은 신장 영역의 표피 세포에서 거의 모든 피질 미세소관이 사라지는 것을 보여주었습니다(그림 6b).이러한 결과는 쿠마모토산 및 그 유도체가 미세소관에 직접 또는 간접적으로 작용하여 미세소관을 파괴하고 이러한 화합물이 새로운 미세소관 억제제임을 나타냅니다.
우르소닉산과 그 유도체는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 피질 미세소관을 변경합니다.(a) 표시된 농도에서 다양한 우르모토산 유도체가 존재할 때 측정된 뿌리 경사각.미세소관을 억제하는 것으로 알려진 두 가지 화합물인 디소피라미드와 오리잘린의 효과도 분석되었습니다.삽입된 그림은 뿌리 성장 각도를 측정하는 데 사용되는 표준을 보여줍니다.별표는 가짜 치료와의 유의미한 차이를 나타냅니다(t 테스트, p< 0.05).엔>19. 스케일 바 = 1cm.(b) 신장 영역의 표피 세포에 있는 피질 미세소관.25μM KAND 11이 있거나 없는 MS 플레이트에서 성장한 야생형 Arabidopsis Col 뿌리의 미세소관은 β-tubulin 1차 항체와 Alexa Fluor-접합 2차 항체를 사용한 면역조직화학적 염색으로 시각화되었습니다.스케일 바 = 10 μm.(c) 뿌리 분열조직의 미세소관의 유사분열 구조.면역조직화학적 염색을 사용하여 미세소관을 시각화하였다.전상 구역, 방추 및 식립체를 포함한 유사분열 구조를 공초점 이미지로부터 계산했습니다.화살표는 유사분열 미세소관 구조를 나타냅니다.별표는 가짜 치료와의 유의미한 차이를 나타냅니다(t 테스트, p< 0.05).엔>9. 스케일 바 = 50μm.
Ursa는 미세소관 기능을 방해하는 능력이 있지만 그 작용 메커니즘은 일반적인 미세소관 해중합제와 다를 것으로 예상됩니다.예를 들어, 디소피라미드 및 오리잘린과 같은 미세소관 해중합제의 농도가 높을수록 표피 세포의 이방성 확장이 유도되는 반면, KAND 11은 그렇지 않습니다.또한, KAND 11과 디소피라미드의 공동 적용으로 인해 디소피라미드에 의해 유발된 뿌리 성장 반응이 결합되었고 KAND 11에 의해 유발된 성장 억제가 관찰되었습니다(그림 S4).우리는 또한 KAND 11에 대한 과민성 디소피라미드 1-1(phs1-1) 돌연변이의 반응을 분석했습니다. phs1-1은 비정규적인 튜불린 키나제 점 돌연변이를 가지며 디소피라미드로 치료할 때 더 짧은 뿌리를 생성합니다9,20.KAND 11이 포함된 한천 배지에서 자란 phs1-1 돌연변이 묘목은 디소피라미드에서 자란 것과 유사한 짧은 뿌리를 가졌습니다(그림 S5).
또한, 우리는 KAND 11로 처리된 묘목의 뿌리 분열 조직에서 전상 구역, 방추 및 식립체와 같은 유사분열 미세소관 구조를 관찰했습니다. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS에 대한 관찰과 일치하여, 유사분열 미세소관의 수가 관찰되었습니다(그림 .6c).
세포하 분해능에서 KAND 11의 세포독성을 특성화하기 위해 담배 BY-2 현탁 세포를 KAND 11로 처리하고 반응을 관찰했습니다.우리는 대뇌 피질의 미세 소관에 대한 KAND 11의 효과를 평가하기 위해 먼저 미세 소관을 형광 표지하는 TagRFP-TUA6을 발현하는 BY-2 세포에 KAND 11을 추가했습니다.피질 미세소관 밀도는 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 백분율을 정량화하는 이미지 분석을 사용하여 평가되었습니다.분석 결과, 50μM 또는 100μM KAND 11을 1시간 처리한 후 밀도는 각각 0.94±0.74%, 0.23±0.28%로 크게 감소한 반면, DMSO를 처리한 세포의 밀도는 1.61±0.34로 나타났다. %(그림 7a).이러한 결과는 KAND 11 처리가 피질 미세소관의 해중합을 유도한다는 Arabidopsis의 관찰과 일치합니다(그림 6b).우리는 또한 동일한 농도의 KAND 11로 처리한 후 GFP-ABD로 표지된 액틴 필라멘트가 있는 BY-2 계통을 조사한 결과 KAND 11 처리가 액틴 필라멘트를 파괴하는 것을 관찰했습니다.50μM 또는 100μM KAND 11을 1시간 동안 처리하면 액틴 필라멘트 밀도가 각각 1.20 ± 0.62% 또는 0.61 ± 0.26%로 크게 감소한 반면, DMSO 처리 세포의 밀도는 1.69 ± 0.51%였습니다(그림 2).7b).이러한 결과는 액틴 필라멘트에 영향을 미치지 않는 프로피자마이드 및 미세소관에 영향을 주지 않는 액틴 해중합제인 라트룬쿨린 B의 효과와 대조됩니다(SI 그림 S6).또한 coumamonamide 1, coumamonamide acid 6 또는 KAND 11 처리는 HeLa 세포의 미세 소관에 영향을 미치지 않았습니다 (SI 그림 S7).따라서 KAND 11의 작용 메커니즘은 알려진 세포골격 교란물질의 작용 메커니즘과 다른 것으로 여겨집니다.또한 KAND 11을 처리한 BY-2 세포를 현미경으로 관찰한 결과 KAND 11 처리 중 세포 사멸이 시작되었으며 KAND 11 처리 30분 후에도 Evans blue로 염색된 죽은 세포의 비율이 크게 증가하지 않은 것으로 나타났습니다. 50μM 또는 100μM KAND로 90분 처리한 후 죽은 세포의 수가 각각 43.7% 또는 80.1%로 증가했습니다(그림 7c).종합해보면, 이들 데이터는 새로운 우르솔산 유도체 KAND 11이 이전에 알려지지 않은 작용 메커니즘을 가진 식물 특이적 세포골격 억제제임을 나타냅니다.
KAND는 피질 미세소관, 액틴 필라멘트 및 담배 BY-2 세포의 생존 가능성에 영향을 미칩니다.(a) TagRFP-TUA6이 있는 경우 BY-2 세포에서 피질 미세소관의 시각화.KAND 11(50μM 또는 100μM) 또는 DMSO로 처리된 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 검사했습니다.피질 미세소관 밀도는 25개의 독립적인 세포의 현미경 사진으로부터 계산되었습니다.문자는 상당한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 테스트, p< 0.05).스케일 바 = 10 μm.(b) GFP-ABD2의 존재 하에서 시각화된 BY-2 세포의 피질 액틴 필라멘트.KAND 11(50μM 또는 100μM) 또는 DMSO로 처리된 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 검사했습니다.피질 액틴 필라멘트의 밀도는 25개의 독립 세포의 현미경 사진으로부터 계산되었습니다.문자는 상당한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 테스트, p< 0.05).스케일 바 = 10 μm.(c) 에반스 블루 염색에 의한 죽은 BY-2 세포의 관찰.KAND 11(50μM 또는 100μM) 또는 DMSO로 처리된 BY-2 세포를 명시야 현미경으로 검사했습니다.n=3.스케일 바 = 100 μm.
새로운 천연물의 발견과 응용은 의학과 농업을 포함한 인간 생활의 다양한 측면에서 상당한 발전을 가져왔습니다.천연자원으로부터 유용한 화합물을 얻기 위한 역사적 연구가 진행되어 왔습니다.특히, 방선균은 이버멕틴의 주요 화합물인 아베르멕틴과 항암제로 의학적으로 사용되는 블레오마이신 및 그 유도체와 같은 다양한 2차 대사산물을 생성하는 능력으로 인해 선충에 대한 구충 항생제로 유용한 것으로 알려져 있습니다21,22.마찬가지로, 방선균에서 다양한 제초 화합물이 발견되었으며, 그 중 일부는 이미 상업적으로 사용되었습니다1,23.따라서 원하는 생물학적 활성을 지닌 천연물을 분리하기 위한 방선균 대사산물 분석이 효과적인 전략으로 간주됩니다.본 연구에서는 S. werraensis로부터 새로운 화합물인 coumamonamide를 발견하고 이를 합성하는데 성공하였습니다.우르소닉산은 우르벤아미드와 그 유도체의 합성 중간체입니다.이는 특징적인 뿌리 말림을 유발하고 중간 내지 강한 제초 활성을 나타내며 식물의 미세소관을 직간접적으로 손상시킬 수 있습니다.그러나 우르모토산의 작용 메커니즘은 기존 미세소관 억제제의 작용 메커니즘과 다를 수 있습니다. KAND 11은 또한 액틴 필라멘트를 파괴하고 세포 사멸을 유발하기 때문에 우르모토산과 그 유도체가 광범위한 세포골격 구조에 영향을 미치는 조절 메커니즘을 암시합니다..
우르베논산의 더욱 상세한 특성화는 우베논산의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.특히, 다음 목표는 우르소닉산과 그 유도체가 미세소관에 직접 작용하여 해중합을 일으키는지, 아니면 그 작용이 미세소관 불안정화를 초래하는지 여부를 결정하기 위해 감소된 미세소관에 결합하는 우르닉산의 능력을 평가하는 것입니다.또한, 미세소관이 직접적인 표적이 아닌 경우, 식물 세포에서 우르손산의 작용 부위와 분자 표적을 확인하는 것은 관련 화합물의 특성과 제초 활성을 향상시킬 수 있는 방법을 더 깊이 이해하는 데 도움이 될 것입니다.우리의 생체활성 분석에서는 애기장대, 담배, 우산이끼와 같은 식물의 성장에 대한 우르소닉산의 독특한 세포독성 능력이 밝혀졌지만 대장균이나 HeLa 세포는 영향을 받지 않았습니다.우르소닉산 유도체를 개방형 농업 분야에서 사용하기 위한 제초제로 개발할 경우 동물 세포에 대한 독성이 거의 없거나 전혀 없다는 점은 우르소닉산 유도체의 장점입니다.실제로 미세소관은 진핵생물의 일반적인 구조이기 때문에 식물에서 미세소관을 선택적으로 억제하는 것은 제초제의 핵심 요구 사항입니다.예를 들어, 튜불린에 직접 결합하여 중합을 억제하는 미세소관 해중합제인 프로피자미드는 동물 세포에 대한 독성이 낮기 때문에 제초제로 사용됩니다.디소피라미드와 달리 관련 벤즈아미드는 표적 특이성이 다릅니다.식물 미세소관 외에도 RH-4032 또는 벤족사미드는 각각 동물 세포 또는 난균의 미세소관을 억제하며, 잘릴아미드는 식물 독성이 낮기 때문에 살균제로 사용됩니다25,26,27.새로 발견된 곰과 그 파생물은 식물에 대해 선택적 세포독성을 나타내지만, 추가 변형을 통해 표적 특이성을 변경하여 잠재적으로 병원성 진균이나 난균류 제어를 위한 추가 파생물을 제공할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
우르베논산과 그 유도체의 독특한 특성은 제초제 개발 및 연구 도구로 사용하는 데 유용합니다.식물 세포 모양을 조절하는 데 있어 세포골격의 중요성은 널리 알려져 있습니다.이전 연구에서는 식물이 형태 형성을 적절하게 제어하기 위해 미세소관 역학을 제어함으로써 피질 미세소관 조직의 복잡한 메커니즘을 진화시켰다는 사실이 밝혀졌습니다.미세소관 활동의 조절을 담당하는 수많은 분자가 확인되었으며 관련 연구가 여전히 진행 중입니다3,4,28.식물 세포의 미세소관 역학에 대한 우리의 현재 이해는 피질 미세소관 구성의 메커니즘을 완전히 설명하지 못합니다.예를 들어, 디소피라미드와 오리잘린은 모두 미세소관을 해중합할 수 있지만 디소피라미드는 심각한 뿌리 왜곡을 일으키는 반면 오리잘린은 상대적으로 약한 효과를 나타냅니다.더욱이, 미세소관을 안정화시키는 튜불린의 돌연변이는 뿌리의 우회전을 유발하는 반면, 미세소관 역학을 안정화시키는 파클리탁셀은 그렇지 않습니다.따라서 우르솔산의 분자 표적을 연구하고 식별하는 것은 식물 피질 미세소관의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공해야 합니다.마찬가지로, 디소피라미드와 같이 왜곡된 성장을 촉진하는 데 효과적인 화학물질과 오리잘린이나 쿠마모토산과 같은 덜 효과적인 화학물질을 향후 비교하면 왜곡된 성장이 어떻게 발생하는지에 대한 단서를 제공할 것입니다.
반면, 방어 관련 세포골격 재배열은 우르소닉산의 세포독성을 설명하는 또 다른 가능성입니다.병원체의 감염이나 식물 세포에 유도물질의 도입은 때때로 세포골격의 파괴와 그에 따른 세포 사멸을 초래합니다.예를 들어 난균 유래 크립토잔틴은 KAND 치료에서 발생하는 것과 유사하게 담배 세포가 죽기 전에 미세소관과 액틴 필라멘트를 파괴하는 것으로 보고되었습니다30,31.크립토잔틴보다 우르소닉산의 효과가 더 빠르고 강력하다는 것이 분명하기는 하지만 우르소닉산에 의해 유도된 방어 반응과 세포 반응 사이의 유사성으로 인해 우르소닉산이 일반적인 세포 과정을 유발한다는 가설이 세워졌습니다.그러나 연구에 따르면 액틴 필라멘트의 파괴는 자발적인 세포 사멸을 촉진하며, 이는 항상 미세소관 파괴를 동반하지는 않습니다.또한, 우르소닉산 유도체처럼 병원체나 유발물질이 왜곡된 뿌리 성장을 유발하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다.따라서 방어 반응과 세포골격을 연결하는 분자 지식은 해결해야 할 매력적인 문제입니다.우르소닉산과 관련된 저분자량 화합물과 다양한 효능을 지닌 다양한 유도체의 존재를 활용함으로써 알려지지 않은 세포 메커니즘을 표적으로 삼을 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.
종합하면, 미세소관 역학을 조절하는 새로운 화합물의 발견과 적용은 식물 세포 형태 결정의 기초가 되는 복잡한 분자 메커니즘을 다루는 강력한 방법을 제공할 것입니다.이러한 맥락에서 미세소관과 액틴 필라멘트에 영향을 미치고 세포 사멸을 유도하는 최근 개발된 복합 우르모토산은 미세소관 제어와 이러한 다른 메커니즘 사이의 연관성을 해독할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.따라서 우르베논산을 이용한 화학적, 생물학적 분석은 식물의 세포골격을 조절하는 분자 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
S. werraensis MK493-CF1을 2%(w/v) 갈락토오스, 2%(w/v) 에센스 페이스트, 1%(w/v) 박토 조성물로 구성된 종자 배지 110mL가 들어 있는 500mL 배플 삼각 플라스크에 접종합니다. .- 탈이온수에 간장(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5%(w/v) 옥수수 추출물(KOGOSTCH Co., Ltd., 일본), 0.2%(w/v) (NH4)2SO4 및 0.2% CaCO3.(멸균 전 pH 7.4).종균 배양물을 회전식 진탕기(180rpm)에서 27°C에서 2일 동안 배양했습니다.고체 발효를 통한 생산 재배.종자 배양물(7ml)을 압착 보리(MUSO Co., Ltd., 일본) 15g과 탈이온수(pH 미조정)로 구성된 생산 배지 40g이 들어 있는 500ml K-1 플라스크에 옮겼습니다. 살균 전) .).발효는 14일 동안 암실에서 30°C에서 진행되었다.발효물질을 40ml/병 EtOH로 추출하고 원심분리하였다(1500g, 4°C, 10분).배양 상층액(60ml)을 10% MeOH/EtOAc의 혼합물로 추출했습니다.유기층을 감압 하에서 증발시켜 잔류물(59.5 mg)을 얻었고, 이를 역상 컬럼(SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID)에서 구배 용출(0-10분: 90%)으로 HPLC를 수행했습니다. 10mm × 길이 250mm) H2O/CH3CN, 10~35분: 90% H2O/CH3CN ~ 70% H2O/CH3CN(구배), 35~45분: 90% H2O/EtOH, 45~155분: 90% H2O /EtOH에서 100% EtOH(구배(구배), 155-200분: 100% EtOH)를 1.5ml/분의 유속으로 처리하면 쿠마몬아미드(1, 36.0mg)가 흰색 무정형 분말로 분리되었습니다.
구마모토아미드(1);1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 6.93(t, J = 2.5Hz, 1H), 6.76(dd, J = 4.3, 1.8Hz 1H), 6.05(t, J = 3.8Hz, 1H).), 4.08(s, 3H);13C-NMR(125MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 계산값: 141.0659, 측정값: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
컬럼비아 종자(Col-0)는 연구용 허가를 받아 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)에서 입수했습니다.Col-0 종자는 실험실 조건에서 번식 및 유지되었으며 야생형 애기장대 식물로 사용되었습니다.애기장대 종자를 표면 멸균하고 2% 수크로스(Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05%(w/v) 2-(4-모르폴리노)에탄설폰산(MES)(Fujifilm Wako Pure Chemical)을 함유하는 절반 강도 Murashige 및 Skoog 배지에서 배양했습니다. ).) 및 1.5% 한천(Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23°C 및 일정한 빛.phs1-1 돌연변이의 종자는 T. Hashimoto(나라 과학 기술 연구소)에서 제공되었습니다.
SR-1 균주의 종자는 T. Hashimoto(나라 과학 기술 연구소)에서 제공되었으며 야생형 담배 식물로 사용되었습니다.담배 종자를 표면 멸균하고 멸균수에 3일 동안 담가서 발아를 촉진시킨 후 2% 수크로스, 0.05%(w/v) MES 및 0.8% 젤란검(Fujifilm Wako Pure Chemical)을 함유한 절반 농도의 용액에 넣었습니다. 무라시게.및 Skoog 배지)를 pH 5.7로 하고 일정한 빛 아래 23°C에서 배양했습니다.
균주 Tak-1은 T. Kohchi(교토 대학)에서 제공되었으며 간이끼 연구를 위한 표준 실험 단위로 사용되었습니다.Gemma는 멸균된 배양 식물에서 얻은 후 1% 수크로스와 0.3% 젤란 검을 포함하는 Gamborg B5 배지(Fujifilm Wako Pure Chemical)에 도말하고 연속 조명 하에서 23°C에서 배양했습니다.
담배 BY-2 세포(Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)는 S. Hasezawa(도쿄 대학)에서 제공받았습니다.BY-2 세포를 변형된 Linsmeier 및 Skoog 배지에서 95배 희석하고 매주 2,4-디클로로페녹시아세트산을 보충했습니다32.세포 현탁액을 회전식 진탕기에서 암실에서 27°C에서 130rpm으로 혼합했습니다.10배의 신선한 배지로 세포를 세척하고 동일한 배지에 재현탁합니다.콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 아래 미세소관 마커 TagRFP-TUA6 또는 액틴 필라멘트 마커 GFP-ABD2를 안정적으로 발현하는 BY-2 형질전환 세포주는 설명된 대로 생성되었습니다.이러한 세포주는 원래 BY-2 세포주에 사용된 것과 유사한 절차를 사용하여 유지 및 동기화될 수 있습니다.
HeLa 세포를 10% 소 태아 혈청, 1.2 U/ml 페니실린 및 1.2 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM)(Life Technologies)에서 5% CO2가 있는 37°C 인큐베이터에서 배양했습니다.
이 원고에 설명된 모든 실험은 일본의 생물 안전 규정 및 지침에 따라 수행되었습니다.
화합물을 스톡 용액으로 디메틸 설폭사이드(DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical)에 용해시키고 애기장대 및 담배의 경우 MS 배지 또는 간이끼의 경우 Gamborg B5 배지로 희석했습니다.뿌리 성장 억제 분석을 위해, 플레이트당 10개 이상의 종자를 지시된 화합물 또는 DMSO를 함유하는 한천 배지에 파종했습니다.종자를 성장 챔버에서 7일 동안 배양하였다.묘목을 촬영하고 뿌리의 길이를 측정했습니다.애기장대 발아 분석을 위해, 플레이트당 48개의 종자를 200μM 화합물 또는 DMSO를 함유하는 한천 배지에 파종했습니다.애기장대 종자를 성장실에서 재배하고, 발아 후 7일(dag)에 발아된 묘목의 수를 계수하였다.담배 발아 분석을 위해, 플레이트당 24개의 종자를 200 μM KAND 또는 DMSO를 함유한 한천 배지에 뿌렸습니다.담배 종자를 성장실에서 재배하고 14일 후에 발아된 묘목의 수를 세었습니다.간이끼 성장 억제 분석을 위해, 각 플레이트의 9개 배아를 표시된 농도의 KAND 또는 DMSO가 포함된 한천 배지에 도말하고 성장 챔버에서 14일 동안 배양했습니다.
뿌리 분열 조직 조직을 시각화하려면 5 mg/ml 요오드화 프로피듐(PI)으로 염색된 묘목을 사용하십시오.PI 신호는 TCS SPE 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 형광 현미경으로 관찰되었습니다.
β-글루쿠로니다제(GUS)를 사용한 뿌리의 조직화학적 염색은 Malami 및 Benfey36에 의해 기술된 프로토콜에 따라 수행되었습니다.묘목을 밤새 90% 아세톤에 고정시키고 GUS 완충액 중 0.5mg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-d-글루쿠론산으로 1시간 동안 염색한 후 수화된 클로르알데히드 용액에 두었습니다.(8 g 염소 수화물, 2 ml 물 및 1 ml 글리세롤) Axio Imager M1 현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 시차 간섭 대비 현미경으로 관찰했습니다.
뿌리 각도는 수직으로 놓인 접시에 자란 7일 된 묘목에서 측정되었습니다.6단계에서 설명한 대로 중력 벡터 방향에서 루트 각도를 측정합니다.
피질 미세소관의 배열은 프로토콜 37을 약간 수정하여 설명한 대로 관찰되었습니다.항-β-튜불린 항체(KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) 및 Alexa Fluor 488-결합 항-마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A32723)를 1:1000 및 1:100 희석에서 1차 및 2차 항체로 사용했습니다. 각기.TCS SPE 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 형광 이미지를 획득했습니다.Z 스택 이미지를 획득하고 제조업체의 지침에 따라 최대 강도 투영을 만듭니다.
HeLa 세포 증식 분석은 Cell Counting Kit 8(Dojindo)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
E. coli DH5α의 성장은 600 nm(OD600)에서 분광광도계를 사용하여 배양물 중 세포 밀도를 측정하여 분석했습니다.
CSU-X1 공초점 스캐닝 장치(Yokogawa)와 sCMOS 카메라(Zyla, Andor Technology)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 형질전환 BY-2 세포의 세포골격 조직을 관찰했습니다.세포골격 밀도는 설명된 대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 공초점 이미지의 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 백분율을 정량화한 이미지 분석을 통해 평가되었습니다.
BY-2 세포에서 세포 사멸을 검출하기 위해, 세포 현탁액의 분취량을 실온에서 10분 동안 0.05% Evans blue와 함께 배양했습니다.죽은 세포의 선택적 에반스 블루 염색은 손상되지 않은 원형질막40에 의한 생존 세포로부터 염료의 압출에 달려 있습니다.염색된 세포는 명시야현미경(BX53, Olympus)을 이용하여 관찰하였다.
HeLa 세포는 37°C 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 10% FBS가 보충된 DMEM에서 성장했습니다.세포를 100μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100ng/ml colcemid(Gibco) 또는 100ng/ml Nocodmaze(Sigma)로 37°C에서 6시간 동안 처리했습니다.세포를 MetOH로 10분 동안 고정한 다음, 아세테이트로 실온에서 5분 동안 고정했습니다.고정된 세포를 0.5% BSA/PBS에 희석된 β-튜불린 1차 항체(1D4A4, Proteintech: 66240-1)와 함께 2시간 동안 배양하고, TBST로 3회 세척한 후 Alexa Fluor 염소 항체와 함께 배양했습니다.488 1시간.– 0.5% BSA/PBS에 희석된 마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A11001) 및 15ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI).TBST로 3회 세척한 후 Nikon Eclipse Ti-E 도립현미경으로 염색된 세포를 관찰하였다.MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 냉각된 Hamamatsu ORCA-R2 CCD 카메라로 이미지를 캡처했습니다.
게시 시간: 2024년 6월 17일