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천연물의 발견과 유익한 활용은 인류의 삶의 질 향상에 기여할 수 있습니다. 식물 생장 억제 화학물질은 잡초 방제를 위한 제초제로 널리 사용되고 있습니다. 다양한 종류의 제초제 사용 필요성으로 인해 새로운 작용 메커니즘을 가진 화합물 발굴의 필요성이 대두되고 있습니다. 본 연구에서는 Streptomyces werraensis MK493-CF1 균주에서 새로운 N-알콕시피롤 화합물인 쿠마모나미드를 발견하고 완전한 합성 과정을 확립했습니다. 생물학적 활성 분석을 통해 우르스-모노아믹산이 우르스-모노아미드의 합성 중간체이며 잠재적인 활성 물질임을 확인했습니다.식물 생장 억제제또한, 우리는 HeLa 세포의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 높은 제초 활성을 나타내는 우르베닐옥시 유도체(UDA)를 포함한 다양한 우르베노닉산 유도체를 개발했습니다. 더불어, 우르모토닉산 유도체가 식물 미세소관을 파괴한다는 사실을 발견했으며, KAND는 액틴 필라멘트에 영향을 미쳐 세포 사멸을 유도합니다. 이러한 다면적인 효과는 기존의 미세소관 억제제와는 다르며, 우르소닉산의 새로운 작용 메커니즘을 시사합니다. 이는 새로운 제초제 개발에 중요한 이점을 제공합니다.
유익한 천연물과 그 유도체의 발견 및 실용화는 인간 삶의 질을 향상시키는 수단입니다. 미생물, 식물, 곤충이 생산하는 이차 대사산물은 의학과 농업 분야에 큰 발전을 가져왔습니다. 많은 항생제와 항백혈병제가 천연물로부터 개발되었습니다. 또한, 다양한 종류의 천연물 유래 물질들이 활용되고 있습니다.살충제살균제와 제초제는 이러한 천연물에서 추출되어 농업에 사용됩니다. 특히 잡초 방제를 위한 제초제는 현대 농업에서 작물 수확량을 늘리는 데 중요한 도구이며, 다양한 종류의 화합물이 이미 상업적으로 사용되고 있습니다. 광합성, 아미노산 대사, 세포벽 합성, 유사분열 조절, 식물 호르몬 신호 전달, 단백질 합성 등 식물의 여러 세포 과정이 제초제의 대표적인 표적으로 여겨집니다. 미세소관 기능을 억제하는 화합물은 유사분열 조절에 영향을 미쳐 식물 생장에 영향을 미치는 일반적인 제초제 종류입니다.
미세소관은 세포골격의 구성 요소이며 진핵세포에 널리 분포합니다. 튜불린 이종이합체는 α-튜불린과 β-튜불린으로 이루어져 있으며, 13개의 원섬유가 모여 원통형 구조를 형성하는 선형 미세소관 원섬유입니다. 미세소관은 식물 세포에서 세포 형태 결정, 세포 분열, 세포 내 물질 수송 등 다양한 역할을 수행합니다.3,4 식물 세포는 세포 분열 간기 동안 세포막 아래에 미세소관을 가지고 있으며, 이러한 피질 미세소관은 셀룰로오스 합성효소 복합체의 조절을 통해 셀룰로오스 미세섬유의 구조를 제어하는 것으로 알려져 있습니다.4,5 뿌리 끝의 급속 신장 부위에 존재하는 뿌리 표피 세포의 피질 미세소관은 측면에 위치하며, 셀룰로오스 미세섬유는 이러한 미세소관을 따라 세포 신장 방향을 제한하여 세포의 비등방성 신장을 촉진합니다. 따라서 미세소관의 기능은 식물 형태와 밀접한 관련이 있습니다. 튜불린을 코딩하는 유전자의 아미노산 치환은 애기장대(Arabidopsis)에서 피질 미세소관 배열의 비대칭과 좌측 또는 우측 생장을 유발합니다.6,7 마찬가지로, 미세소관 역학을 조절하는 미세소관 관련 단백질의 돌연변이 또한 뿌리 생장의 왜곡을 초래할 수 있습니다.8,9,10,11,12,13 또한, 디소피라미드(프레틸라클로르라고도 함)와 같은 미세소관 파괴 제초제 처리도 좌측 사선 뿌리 생장을 유발합니다.14 이러한 데이터는 미세소관 기능의 정밀한 조절이 식물 생장 방향을 결정하는 데 매우 중요하다는 것을 시사합니다.
다양한 종류의 미세소관 억제제가 발견되었으며, 이러한 약물들은 세포골격 연구뿐만 아니라 농업과 의학에도 상당한 기여를 해왔습니다.2 특히, 오리잘린, 디니트로아닐린 화합물, 디소피라미드, 벤즈아미드 관련 화합물 및 이들의 유사체는 미세소관 기능을 억제하여 식물 생장을 저해할 수 있습니다. 따라서 이들은 제초제로 널리 사용되고 있습니다. 그러나 미세소관은 식물 세포와 동물 세포의 중요한 구성 요소이기 때문에 대부분의 미세소관 억제제는 두 세포 유형 모두에 세포독성을 나타냅니다. 따라서 제초제로서의 유용성이 인정됨에도 불구하고 실제 사용에 적합한 항미세소관제는 제한적입니다.
스트렙토마이세스(Streptomyces)는 호기성, 그람 양성, 사상균을 포함하는 스트렙토마이세스과의 한 속으로, 다양한 이차 대사산물을 생성하는 능력으로 널리 알려져 있습니다. 따라서 생물학적 활성을 지닌 새로운 천연물질의 중요한 공급원 중 하나로 여겨집니다. 본 연구에서는 Streptomyces werraensis MK493-CF1과 S. werraensis ISP 5486 균주에서 쿠마모나미드(coumamonamide)라는 새로운 화합물을 분리해냈습니다. 스펙트럼 분석 및 전체 스펙트럼 분석을 통해 쿠마모나미드의 구조를 규명하고, 독특한 N-알콕시피롤 골격을 확인했습니다. 또한, 쿠마모나미드 및 그 유도체의 합성 중간체인 우르스몬산(ursmonic acid)이 대표적인 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 생장과 발아를 억제하는 것을 확인했습니다. 구조-활성 관계 연구에서, C9 위치가 우르소닉산으로 변형된 화합물인 우르소닉산 노닐옥시 유도체(KAND)가 식물 생장 및 발아 억제 효과를 현저히 향상시키는 것을 발견했습니다. 특히, 새로 발견된 식물 생장 억제제는 담배와 우산이끼의 생장에도 영향을 미쳤으며, 세균이나 HeLa 세포에는 세포독성을 나타내지 않았습니다. 또한, 일부 우르모토닉산 유도체는 뿌리 형태 이상을 유발하는데, 이는 이들 유도체가 미세소관에 직간접적으로 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 이러한 가설과 일치하게, 면역조직화학적 방법이나 형광 단백질로 표지된 미세소관에 대한 관찰 결과, KAND 처리가 미세소관을 탈중합시키는 것으로 나타났습니다. 더불어, 쿠마모토닉산 유도체 처리는 액틴 미세섬유를 파괴했습니다. 따라서, 우리는 세포골격 파괴라는 독특한 작용 기전을 가진 새로운 식물 생장 억제제를 발견했습니다.
MK493-CF1 균주는 도쿄 시나가와구의 토양에서 분리되었습니다. 이 균주는 분지가 잘 된 균사체를 형성했습니다. 16S 리보솜 RNA 유전자(1422 bp)의 부분 염기서열을 분석한 결과, S. werraensis(NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: 대표 균주, 99.93%)와 매우 유사했습니다. 이 결과를 바탕으로, 이 균주가 S. werraensis의 기준 균주와 밀접한 관련이 있다고 판단하여, 잠정적으로 S. werraensis MK493-CF1으로 명명했습니다. S. werraensis ISP 5486T 또한 동일한 생리활성 물질을 생산합니다. 이 미생물로부터 천연물을 얻는 연구가 미미했기에, 본 연구에서는 추가적인 화학 연구를 수행했습니다. 보리 배지에서 S. werraensis MK493-CF1을 30°C에서 14일 동안 고체 발효시킨 후, 배지를 50% 에탄올로 추출하였다. 추출액 60ml를 건조하여 조추출물 59.5mg을 얻었다. 이 조추출물을 역상 HPLC로 분리하여 N-메톡시-1H-피롤-2-카르복사미드(1, 쿠마모나미드) 36.0mg을 얻었다. 화합물 1의 총량은 조추출물의 약 60%에 해당한다. 따라서 본 연구에서는 쿠마모나미드 1의 특성을 상세히 연구하기로 하였다.
쿠마모나미드 1은 백색의 비정질 분말이며, 고해상도 질량 분석법(HRESIMS)을 통해 C6H8N2O2임을 확인하였다(그림 1). 이 화합물의 C2 위치에 치환된 피롤 조각은 δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR 스펙트럼에서의 δH: 4.5 Hz, H-5) 및 δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)에서 특징적으로 나타나며, 13C NMR 스펙트럼에서는 4개의 sp2 탄소 원자가 존재함을 보여준다. C2 위치에 아미드기가 존재함은 C-3 양성자에서 δC 161.1의 아미드 카르보닐 탄소로의 HMBC 상관관계를 통해 확인되었다. 또한, δH 4.10 (3H, S) 및 δC 68.3에서의 1H 및 13C NMR 피크는 분자 내에 N-메톡시기가 존재함을 나타낸다. 증강차분광법(EDR) 및 핵 오버하우저 약어(NOEDF)와 같은 분광학적 분석을 통해 메톡시기의 정확한 위치는 아직 확인되지 않았지만, N-메톡시-1H-피롤-2-카르복스아미드가 첫 번째 후보 화합물로 선정되었다.
화합물 1의 정확한 구조를 규명하기 위해 전합성을 수행하였다(그림 2a). 시판되는 2-아미노피리딘 2를 m-CPBA로 처리하여 상응하는 N-산화물 3을 정량적 수율로 얻었다. 2의 2-아미노아지드화 반응 후, 아브라모비치가 기술한 고리화 반응을 벤젠 용매에서 90°C로 진행하여 원하는 1-하이드록시-1H-피롤-2-카르보니트릴 5를 60% 수율(2단계)로 얻었다. 15,16 이어서 4를 메틸화 및 가수분해하여 1-메톡시-1H-피롤-2-카르복실산("쿠모토닉산", 6)을 70%의 높은 수율(2단계)로 얻었다. 마지막으로, 산 염화물 중간체 6을 수산화암모늄 수용액을 사용하여 아미드화 반응을 수행하여 쿠마모토 아미드 1을 98% 수율로 얻었다. 합성된 1의 모든 스펙트럼 데이터는 분리된 1과 유사했으므로 1의 구조가 결정되었다.
우르베나미드 및 우르베닉산의 일반적인 합성 및 생물학적 활성 분석. (a) 쿠마모토 아미드의 전합성. (b) 7일 된 야생형 애기장대 콜롬비아(Col) 묘목을 표시된 농도의 쿠마모나미드 6 또는 쿠마모나미드 1이 포함된 무라시게-스코그(MS) 배지에서 재배하였다. 스케일 바 = 1cm.
먼저, 우르베나미드와 그 중간체의 식물 생장 조절 능력에 대한 생물학적 활성을 평가했습니다. MS 한천 배지에 다양한 농도의 우르스모나미드 1 또는 우르스몬산 6을 첨가하고 이 배지에서 애기장대 묘목을 배양했습니다. 이 실험 결과, 고농도(500 μM)의 6은 뿌리 생장을 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 2b). 다음으로, 6의 N1 위치를 치환하여 다양한 유도체를 합성하고 구조-활성 관계 연구를 수행했습니다(유사체 합성 과정은 보충 정보(SI)에 설명되어 있습니다). 애기장대 묘목을 50 μM 우르스몬산 유도체가 포함된 배지에서 재배하고 뿌리 길이를 측정했습니다. 결과는 그림에 나타나 있습니다. 그림 3a, b 및 S1에서 볼 수 있듯이, 쿠마모산 유도체들은 N1 위치에 다양한 길이의 선형 알콕시 사슬(9, 10, 11, 12 및 13) 또는 긴 알콕시 사슬(15, 16 및 17)을 가지고 있습니다. 이들 유도체는 뿌리 생장을 현저하게 억제하는 효과를 보였습니다. 또한, 200 μM 농도의 10, 11 또는 17을 처리했을 때 발아가 억제되는 것을 확인했습니다(그림 3c 및 S2).
쿠마모토 아미드 및 관련 화합물의 구조-활성 관계 연구. (a) 유사체의 구조 및 합성 모식도. (b) 50 μM 쿠마모나미드 유도체를 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 재배한 7일 된 묘목의 뿌리 길이 측정. 별표는 대조군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p < 0.05).< 0.05). n>18. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시됩니다. nt는 종자의 50% 이상이 발아하지 않았기 때문에 "검사하지 않음"을 의미합니다. (c) 200 μM 쿠마모나미드 및 관련 화합물을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 7일 동안 배양한 처리 종자의 발아율을 정량화했습니다. 별표는 위약 처리군과의 유의미한 차이를 나타냅니다(카이제곱 검정). n=96.
흥미롭게도, C9보다 긴 알킬 측쇄를 첨가하면 억제 활성이 감소했는데, 이는 쿠마모토산 관련 화합물이 생물학적 활성을 나타내기 위해서는 특정 크기의 측쇄가 필요하다는 것을 시사합니다.
구조-활성 관계 분석 결과 C9가 우르손산으로 변형되었고, 우르손산의 노닐옥시 유도체(이하 KAND 11)가 가장 효과적인 식물 생장 억제제임을 확인했으므로, KAND 11에 대한 보다 상세한 특성 분석을 수행했습니다. 애기장대에 50 μM의 KAND 11을 처리했을 때 발아가 거의 완전히 억제되었으며, 더 낮은 농도(40, 30, 20 또는 10 μM)의 KAND 11은 농도 의존적으로 뿌리 생장을 억제했습니다(그림 4a, b). KAND 11이 뿌리 분열조직의 생존력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 프로피디움 요오드화물(PI)로 염색한 뿌리 분열조직의 면적을 측정했습니다. 25 μM KAND-11을 함유한 배지에서 재배한 묘목의 분열조직 크기는 151.1 ± 32.5 μm였고, DMSO를 함유한 대조 배지에서 재배한 묘목의 분열조직 크기는 264.7 ± 30.8 μm였다(그림 4c, d). 이는 KAND-11이 세포 분열 활동을 회복시켜 뿌리 분열조직의 성장을 촉진함을 나타낸다. 이와 일관되게, KAND-11 처리는 뿌리 분열조직에서 세포 분열 표지자인 CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS 신호의 양을 감소시켰다(그림 4e)¹⁷. 이러한 결과는 KAND-11이 세포 증식 활동을 감소시켜 뿌리 성장을 억제함을 시사한다.
우르베논산 유도체(우르베닐옥시 유도체)의 생장 억제 효과 분석. (a) 표시된 농도의 KAND 11을 첨가한 MS 배지에서 재배한 7일 된 야생형 Col 묘목. 스케일 바 = 1cm. (b) 뿌리 길이 측정. 문자는 유의미한 차이를 나타낸다(Tukey HSD 검정, p < 0.05).< 0.05). n>16. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시됩니다. (c) 25 μM KAND 11을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 재배한 야생형 Col 뿌리를 프로피디움 요오드로 염색한 공초점 현미경 사진. 흰색 괄호는 뿌리 분열조직을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 µm. (d) 뿌리 분열조직 크기 정량화(n = 10~11). 통계적 차이는 t-검정(p < 0.05)을 사용하여 확인했습니다.< 0.05). 막대는 평균 분열조직 크기를 나타냅니다. (e) CDKB2 구조체를 포함하는 뿌리 분열조직의 미분 간섭 대비(DIC) 현미경 이미지; 1pro: CDKB2; 1-GUS 염색 및 25 µM KAND 첨가 또는 미첨가 MS 배지에서 재배한 5일 된 묘목의 염색.
KAND 11의 식물독성은 쌍떡잎식물인 담배(Nicotiana tabacum)와 주요 육상 식물 모델인 우산이끼(Marchantia polymorpha)를 사용하여 추가적으로 검증하였다. 애기장대(Arabidopsis)의 경우와 마찬가지로, 25 μM KAND 11이 함유된 배지에서 재배한 담배 SR-1 묘목은 뿌리 길이가 더 짧았다(그림 5a). 또한, 200 μM KAND 11이 함유된 배지에서는 48개 종자 중 40개만 발아한 반면, 대조군 배지에서는 48개 종자 모두 발아하여 KAND의 농도가 높을수록 유의미한 차이를 보였다(p < 0.05).< 0.05; 카이제곱 검정) KAND 11은 담배의 발아를 억제했습니다(그림 5b). 또한, 우산이끼에서 세균 성장을 억제하는 KAND 11의 농도는 애기장대에서 효과적인 농도와 유사했습니다(그림 5c). 이러한 결과는 KAND 11이 다양한 식물의 성장을 억제할 수 있음을 시사합니다. 다음으로, 우리는 다른 유기체, 즉 고등 동물 세포와 세균 세포를 각각 대표하는 인간 HeLa 세포와 대장균 DH5α 균주에서 곰 모노아미드 관련 화합물의 세포독성 가능성을 조사했습니다. 일련의 세포 증식 분석에서, 쿠마모나미드 1, 쿠마모나미드산 6 및 KAND 11은 100 μM 농도에서 HeLa 세포 또는 대장균 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 것을 관찰했습니다(그림 5d,e).
KAND 11에 의한 비아라비돕시스 생물체의 생장 억제. (a) 2주 된 야생형 SR-1 담배 묘목을 25 μM KAND 11이 함유된 MS 배지에 수직으로 배양하였다. (b) 2주 된 야생형 SR-1 담배 묘목을 200 μM KAND 11이 함유된 MS 배지에 수평으로 배양하였다. (c) 2주 된 야생형 Tak-1 우산이끼 새싹을 표시된 농도의 KAND 11이 함유된 Gamborg B5 배지에서 배양하였다. 붉은색 화살표는 2주 배양 기간 내에 생장이 멈춘 포자를 나타낸다. (d) HeLa 세포의 세포 증식 분석. 생존 세포 수는 일정 시간 간격으로 세포 계수 키트 8(Dojindo)을 사용하여 측정하였다. 대조군으로 HeLa 세포에 RNA 중합효소 전사를 억제하고 세포 사멸을 유발하는 액티노마이신 D(Act D) 5 μg/ml를 처리하였다. 분석은 3회 반복하여 수행하였다. (e) 대장균 세포 증식 분석. 대장균의 성장은 OD600을 측정하여 분석하였다. 대조군으로, 세균 세포벽 합성을 억제하는 암피실린(Amp) 50 μg/ml을 처리하였다. 분석은 3회 반복하여 수행하였다.
우라미드 관련 화합물에 의한 세포독성 작용 기전을 규명하기 위해, 중간 정도의 억제 효과를 나타내는 우르벤산 유도체들을 재분석하였다(그림 참조). 그림 2b, 6a에서 볼 수 있듯이, 고농도(200 μM)의 우르모톤산 6을 함유한 한천 배지에서 자란 묘목은 뿌리가 짧고 왼쪽으로 휘어진 형태(θ = – 23.7 ± 6.1)를 나타낸 반면, 대조군 배지에서 자란 묘목은 거의 직선형 뿌리(θ = – 3.8 ± 7.1)를 나타냈다. 이러한 특징적인 사선형 생장은 피질 미세소관의 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다14,18. 이러한 결과와 일관되게, 미세소관 불안정화 약물인 디소피라미드와 오리잘린 또한 본 연구 조건에서 유사한 뿌리 기울기를 유도하였다(그림 2b, 6a). 동시에, 우리는 우르모토닉산 유도체들을 시험하고 특정 농도에서 사선 방향 뿌리 생장을 유도하는 몇 가지 화합물을 선별했습니다. 화합물 8, 9, 15는 각각 75μM, 50μM, 40μM 농도에서 뿌리 생장 방향을 변화시켰으며, 이는 이들 화합물이 미세소관을 효과적으로 불안정화시킬 수 있음을 나타냅니다(그림 2b, 6a). 또한, 가장 강력한 우르솔산 유도체인 KAND 11을 더 낮은 농도(15μM)에서 시험한 결과, KAND 11을 처리했을 때 뿌리 생장이 억제되었고, 뿌리 생장 방향은 왼쪽으로 기울어지는 경향을 보였지만 고르지 않았습니다(그림 C3). 미세소관 불안정화 약물의 고농도에서는 뿌리 기울어짐을 유발하기보다는 식물 생장을 억제하는 경우가 있기 때문에, 우리는 KAND 11이 미세소관에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 뿌리 표피 세포의 피층 미세소관을 관찰했습니다. 25 μM KAND 11로 처리한 묘목 뿌리 표피 세포에서 항-β-튜불린 항체를 이용한 면역조직화학 분석 결과, 신장대 표피 세포에서 거의 모든 피질 미세소관이 사라진 것이 관찰되었다(그림 6b). 이러한 결과는 쿠마모토닉산과 그 유도체가 미세소관에 직접 또는 간접적으로 작용하여 미세소관을 파괴하며, 이러한 화합물들이 새로운 미세소관 억제제임을 시사한다.
우르모토닉산과 그 유도체는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 피질 미세소관을 변화시킨다. (a) 표시된 농도의 다양한 우르모토닉산 유도체 존재 하에서 측정한 뿌리 경사각. 미세소관 억제 효과가 있는 것으로 알려진 두 화합물인 디소피라미드와 오리잘린의 효과도 분석하였다. 삽입 그림은 뿌리 생장각 측정에 사용된 표준을 보여준다. 별표는 대조군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p < 0.05).< 0.05). n>19. 스케일 바 = 1cm. (b) 신장대 표피 세포의 피질 미세소관. 25μM KAND 11을 첨가하거나 첨가하지 않은 MS 배지에서 재배한 야생형 Arabidopsis Col 뿌리의 미세소관을 β-튜불린 1차 항체와 Alexa Fluor 접합 2차 항체를 사용한 면역조직화학 염색으로 관찰하였다. 스케일 바 = 10μm. (c) 뿌리 분열조직의 미세소관 분열 구조. 미세소관은 면역조직화학 염색을 이용하여 관찰하였다. 전기 영역, 방추사, 세포판을 포함한 분열 구조는 공초점 현미경 이미지에서 계수하였다. 화살표는 분열 중인 미세소관 구조를 나타낸다. 별표는 대조군과의 유의미한 차이를 나타낸다(t 검정, p < 0.05).< 0.05). n>9. 스케일 바 = 50 µm.
Ursa는 미세소관 기능을 저해하는 능력이 있지만, 그 작용 기전은 일반적인 미세소관 탈중합제와는 다를 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 디소피라미드나 오리잘린과 같은 고농도의 미세소관 탈중합제는 표피 세포의 비등방성 팽창을 유도하는 반면, KAND 11은 그렇지 않습니다. 또한, KAND 11과 디소피라미드를 함께 처리했을 때 디소피라미드에 의한 뿌리 생장 반응과 KAND 11에 의한 생장 억제 반응이 동시에 관찰되었습니다(그림 S4). 우리는 또한 과민성 디소피라미드 1-1(phs1-1) 돌연변이체의 KAND 11에 대한 반응을 분석했습니다. phs1-1은 비정형 튜불린 키나아제 점 돌연변이를 가지고 있으며 디소피라미드 처리 시 뿌리가 짧아집니다9,20. KAND 11이 함유된 한천 배지에서 재배한 phs1-1 돌연변이체 묘목은 디소피라미드에서 재배한 묘목과 유사하게 뿌리가 짧았습니다(그림 S5).
또한, KAND 11로 처리한 묘목의 뿌리 분열 조직에서 전기 영역, 방추체, 세포판과 같은 유사분열 미세소관 구조를 관찰하였다. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS에 대한 관찰 결과와 마찬가지로, 유사분열 미세소관의 수가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(그림 6c).
KAND 11의 세포소기관 수준에서의 세포독성을 규명하기 위해, 담배 BY-2 부유 세포에 KAND 11을 처리하고 그 반응을 관찰하였다. 먼저, 미세소관을 형광 표지하는 TagRFP-TUA6를 발현하는 BY-2 세포에 KAND 11을 첨가하여 피질 미세소관에 대한 KAND 11의 영향을 평가하였다. 피질 미세소관 밀도는 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 비율을 정량화하는 이미지 분석을 통해 측정하였다. 분석 결과, 50 μM 또는 100 μM의 KAND 11을 1시간 동안 처리한 후, 피질 미세소관 밀도는 각각 0.94 ± 0.74% 또는 0.23 ± 0.28%로 유의하게 감소하였으며, DMSO를 처리한 세포의 밀도는 1.61 ± 0.34%였다(그림 7a). 이러한 결과는 KAND 11 처리가 피질 미세소관의 탈중합을 유도한다는 아라비도프시스에서의 관찰 결과와 일치합니다(그림 6b). 또한 동일한 농도의 KAND 11 처리 후 GFP-ABD로 표지된 액틴 필라멘트를 가진 BY-2 세포주를 조사한 결과, KAND 11 처리가 액틴 필라멘트를 파괴하는 것을 관찰했습니다. 50 μM 또는 100 μM의 KAND 11로 1시간 처리했을 때 액틴 필라멘트 밀도는 각각 1.20 ± 0.62% 또는 0.61 ± 0.26%로 유의하게 감소한 반면, DMSO 처리 세포의 밀도는 1.69 ± 0.51%였습니다(그림 2, 7b). 이러한 결과는 액틴 필라멘트에 영향을 미치지 않는 프로피자미드와 미세소관에 영향을 미치지 않는 액틴 탈중합제인 라트룬쿨린 B의 효과와는 대조적입니다(보충 그림 S6). 또한, 쿠마모나미드 1, 쿠마모나미드산 6 또는 KAND 11을 처리해도 HeLa 세포의 미세소관에는 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 S7). 따라서 KAND 11의 작용 기전은 기존에 알려진 세포골격 파괴제와는 다른 것으로 추정됩니다. 또한, KAND 11로 처리한 BY-2 세포를 현미경으로 관찰한 결과, KAND 11 처리 중 세포 사멸이 시작되었으며, 에반스 블루로 염색된 사멸 세포의 비율은 KAND 11 처리 30분 후에는 크게 증가하지 않았지만, 50μM 또는 100μM의 KAND로 90분 처리 후에는 사멸 세포 수가 각각 43.7% 또는 80.1%로 증가했습니다(그림 7c). 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 새로운 우르솔산 유도체인 KAND 11은 기존에 알려지지 않은 작용 기전을 가진 식물 특이적 세포골격 억제제임을 알 수 있습니다.
KAND는 담배 BY-2 세포의 피질 미세소관, 액틴 필라멘트 및 생존력에 영향을 미칩니다. (a) TagRFP-TUA6 존재 하에서 BY-2 세포의 피질 미세소관 시각화. KAND 11(50 μM 또는 100 μM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 관찰했습니다. 피질 미세소관 밀도는 25개의 독립적인 세포의 현미경 사진에서 계산했습니다. 문자는 유의미한 차이를 나타냅니다(Tukey HSD 검정, p < 0.05).(a) GFP-ABD2 존재 하에 시각화된 BY-2 세포의 피질 액틴 필라멘트. KAND 11(50 μM 또는 100 μM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 피질 액틴 필라멘트 밀도는 25개의 독립적인 세포의 현미경 사진에서 계산하였다. 문자는 유의미한 차이를 나타낸다(Tukey HSD 검정, p < 0.05).< 0.05). 스케일 바 = 10 µm. (c) 에반스 블루 염색을 이용한 BY-2 세포 사멸 관찰. KAND 11(50 μM 또는 100 μM) 또는 DMSO로 처리한 BY-2 세포를 명시야 현미경으로 관찰하였다. n=3. 스케일 바 = 100 µm.
새로운 천연물의 발견과 응용은 의학과 농업을 포함한 인간 생활의 다양한 측면에서 상당한 발전을 가져왔습니다. 역사적으로 천연 자원에서 유용한 화합물을 얻기 위한 연구가 진행되어 왔습니다. 특히, 방선균은 이버멕틴의 주요 화합물인 아버멕틴과 항암제로 사용되는 블레오마이신 및 그 유도체와 같은 다양한 이차 대사산물을 생성하는 능력 때문에 선충류에 대한 항기생충 항생제로 유용하게 알려져 있습니다.21,22 마찬가지로, 방선균에서 다양한 제초제 화합물이 발견되었으며, 그중 일부는 이미 상업적으로 사용되고 있습니다.1,23 따라서 원하는 생물학적 활성을 가진 천연물을 분리하기 위해 방선균 대사산물을 분석하는 것은 효과적인 전략으로 여겨집니다. 본 연구에서는 S. werraensis에서 새로운 화합물인 쿠마모나미드를 발견하고 성공적으로 합성했습니다. 우르소닉산은 우르베나미드 및 그 유도체의 합성 중간체입니다. KAND 11은 특징적인 뿌리 말림 현상을 유발하고, 중등도에서 강한 제초 활성을 나타내며, 식물의 미세소관을 직간접적으로 손상시킬 수 있다. 그러나 KAND 11은 액틴 필라멘트도 파괴하고 세포 사멸을 유발하기 때문에, 우르모토닉산의 작용 기전은 기존의 미세소관 억제제와는 다를 수 있으며, 이는 우르모토닉산 및 그 유도체가 광범위한 세포골격 구조에 영향을 미치는 조절 기전을 시사한다.
우르베논산에 대한 보다 상세한 특성 분석은 우르베논산의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, 다음 목표는 우르손산이 환원된 미세소관에 결합하는 능력을 평가하여 우르손산 및 그 유도체가 미세소관에 직접 작용하여 탈중합을 일으키는지, 아니면 미세소관을 불안정화시키는지 확인하는 것입니다. 또한, 미세소관이 직접적인 표적이 아닌 경우, 식물 세포에서 우르손산의 작용 부위와 분자 표적을 규명하는 것은 관련 화합물의 특성을 더 잘 이해하고 제초 활성을 향상시킬 수 있는 방법을 모색하는 데 도움이 될 것입니다. 본 연구의 생물 활성 분석 결과, 우르손산은 애기장대, 담배, 우산이끼와 같은 식물의 생장에 독특한 세포독성을 나타내는 반면, 대장균이나 HeLa 세포에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 동물 세포에 대한 독성이 거의 없거나 전혀 없다는 점은 우르손산 유도체가 개방된 농경지에서 사용할 제초제로 개발될 경우 큰 장점이 될 수 있습니다. 실제로 미세소관은 진핵생물에서 흔히 볼 수 있는 구조이므로 식물에서 미세소관을 선택적으로 억제하는 것은 제초제 개발에 있어 중요한 요건입니다. 예를 들어, 튜불린에 직접 결합하여 중합을 억제하는 미세소관 탈중합제인 프로피자미드는 동물 세포에 대한 독성이 낮아 제초제로 사용됩니다.24 디소피라미드와는 달리, 관련 벤즈아미드 계열 화합물들은 서로 다른 표적 특이성을 나타냅니다. RH-4032 또는 벤족사미드는 식물 미세소관 외에도 각각 동물 세포 또는 난균류의 미세소관을 억제하며, 잘릴아미드는 식물 독성이 낮아 살균제로 사용됩니다.25,26,27 새로 발견된 베어와 그 유도체들은 식물에 대한 선택적 세포독성을 나타내지만, 추가적인 변형을 통해 표적 특이성을 변화시켜 병원성 진균이나 난균류 방제를 위한 추가적인 유도체를 개발할 수 있을 것으로 기대됩니다.
우르베논산과 그 유도체의 독특한 성질은 제초제 개발 및 연구 도구로서의 활용에 유용합니다. 식물 세포 형태 조절에 있어 세포골격의 중요성은 널리 알려져 있습니다. 이전 연구들은 식물이 형태 형성을 적절히 조절하기 위해 미세소관 역학을 제어함으로써 피질 미세소관 조직화의 복잡한 메커니즘을 진화시켜 왔음을 보여주었습니다. 미세소관 활성 조절에 관여하는 수많은 분자들이 확인되었으며, 관련 연구는 현재도 진행 중입니다.3,4,28 그러나 식물 세포 내 미세소관 역학에 대한 현재의 이해는 피질 미세소관 조직화 메커니즘을 완전히 설명하지 못합니다. 예를 들어, 디소피라미드와 오리잘린 모두 미세소관을 탈중합시킬 수 있지만, 디소피라미드는 심각한 뿌리 변형을 유발하는 반면 오리잘린은 비교적 경미한 영향을 미칩니다. 또한, 미세소관을 안정화시키는 튜불린의 돌연변이는 뿌리의 우측 회전을 유발하는 반면, 미세소관 역학을 안정화시키는 파클리탁셀은 그렇지 않습니다. 따라서 우르솔산의 분자적 표적을 연구하고 규명하는 것은 식물 피층 미세소관 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다. 마찬가지로, 디소피라미드와 같이 왜곡된 생장을 유도하는 데 효과적인 화학물질과 오리잘린 또는 쿠마모토릭산과 같이 효과가 덜한 화학물질을 비교하는 연구는 왜곡된 생장이 어떻게 발생하는지에 대한 단서를 제공할 것입니다.
한편, 방어 관련 세포골격 재배열은 우르손산의 세포독성을 설명하는 또 다른 가능성입니다. 병원균 감염이나 유도물질의 식물 세포 도입은 때때로 세포골격 파괴와 그에 따른 세포 사멸을 유발합니다.29 예를 들어, 난균류 유래 크립토잔틴은 KAND 처리 시와 유사하게 담배 세포 사멸에 앞서 미세소관과 액틴 필라멘트를 파괴하는 것으로 보고되었습니다.30,31 이러한 방어 반응과 우르손산에 의해 유도되는 세포 반응 사이의 유사성은 우르손산이 크립토잔틴보다 더 빠르고 강력한 효과를 나타내지만, 공통적인 세포 과정을 유발한다는 가설을 세우게 했습니다. 그러나 액틴 필라멘트 파괴가 자발적인 세포 사멸을 촉진하며, 이는 항상 미세소관 파괴를 동반하는 것은 아니라는 연구 결과도 있습니다.29 또한, 우르손산 유도체처럼 병원균이나 유도물질이 뿌리 생장 이상을 유발하는지 여부는 추가적인 연구가 필요합니다. 따라서 방어 반응과 세포골격을 연결하는 분자 수준의 지식은 해결해야 할 매력적인 과제입니다. 우르손산과 관련된 저분자 화합물 및 다양한 효능을 가진 유도체의 존재를 활용함으로써, 알려지지 않은 세포 메커니즘을 표적으로 삼을 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.
종합적으로 볼 때, 미세소관 역학을 조절하는 새로운 화합물의 발견과 응용은 식물 세포 형태 결정의 기저에 있는 복잡한 분자 메커니즘을 규명하는 강력한 방법을 제공할 것입니다. 이러한 맥락에서, 최근 개발된 우르모토닉산은 미세소관과 액틴 필라멘트에 영향을 미치고 세포 사멸을 유도하는데, 이는 미세소관 조절과 다른 메커니즘들 사이의 연관성을 밝히는 데 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 우르모토닉산을 이용한 화학적 및 생물학적 분석은 식물 세포골격을 조절하는 분자 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
2% (w/v) 갈락토스, 2% (w/v) 에센스 페이스트, 1% (w/v) 박토 조성물-대두(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) 옥수수 추출물(KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 및 0.2% CaCO3를 탈이온수에 용해시킨 110 mL의 종균 배지가 담긴 500 mL 배플형 삼각 플라스크에 S. werraensis MK493-CF1 균주를 접종한다(멸균 전 pH 7.4). 종균 배양액을 27°C에서 2일 동안 회전식 셰이커(180 rpm)에서 배양한다. 생산 배양은 고체 발효법을 통해 진행한다. 종균 배양액(7 ml)을 40 g의 생산 배지(MUSO Co., Ltd., 일본산 압착 보리 15 g과 탈이온수 25 g으로 구성, 멸균 전 pH 조절 안 함)가 들어 있는 500 ml K-1 플라스크에 옮겼다. 발효는 30°C의 암실에서 14일 동안 진행하였다. 발효물을 병당 40 ml의 에탄올로 추출하고 원심분리(1500 g, 4°C, 10분)하였다. 배양 상등액(60 ml)을 10% 메탄올/에틸아세테이트 혼합액으로 추출하였다. 유기층을 감압 하에 증발시켜 잔류물(59.5mg)을 얻었고, 이를 역상 컬럼(SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5μm, 내경 10mm × 길이 250mm)에서 기울기 용리(0–10분: 90%) H2O/CH3CN, 10–35분: 90% H2O/CH3CN에서 70% H2O/CH3CN으로의 기울기, 35–45분: 90% H2O/EtOH, 45–155분: 90% H2O/EtOH에서 100% EtOH로의 기울기, 155–200분: 100% EtOH)를 이용한 HPLC로 분리하였다. 유속은 1.5ml/min이었고, 쿠마모나미드(1, 36.0mg)를 백색 비정질 분말로 분리하였다.
쿠마모토아미드(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 계산값: 141.0659, 측정값: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia 종자(Col-0)는 연구용으로 허가를 받아 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)에서 입수했습니다. Col-0 종자는 저희 연구실 조건에서 증식 및 유지 관리했으며 야생형 Arabidopsis 식물로 사용했습니다. Arabidopsis 종자는 표면 살균 후 2% 수크로오스(Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05%(w/v) 2-(4-모르폴리노)에탄설폰산(MES)(Fujifilm Wako Pure Chemical), 1.5% 한천(Fujifilm Wako Pure Chemical)을 함유한 반농도 Murashige and Skoog 배지에서 pH 5.7로 23°C, 일정 광 조건에서 배양했습니다. phs1-1 돌연변이 종자는 T. Hashimoto(나라 과학기술대학교)로부터 제공받았습니다.
SR-1 균주의 종자는 T. Hashimoto(나라 과학기술대학교)로부터 제공받았으며 야생형 담배 식물로 사용되었습니다. 담배 종자는 표면 살균 후 발아 촉진을 위해 멸균수에 3일 밤 동안 담가 두었습니다. 그 후 2% 수크로오스, 0.05%(w/v) MES, 0.8% 겔란검(후지필름 와코 퓨어 케미컬)을 함유한 반농도 용액(무라시게-스코그 배지, pH 5.7)에 넣어 23°C에서 일정한 광 조건 하에 배양했습니다.
Tak-1 균주는 T. Kohchi(교토대학교)로부터 제공받았으며, 우산이끼 연구의 표준 실험 단위로 사용되었습니다. 무균 배양 식물에서 무성아를 채취하여 1% 수크로오스와 0.3% 겔란검이 함유된 Gamborg B5 배지(Fujifilm Wako Pure Chemical)에 접종하고 23°C에서 연속광 조건으로 배양했습니다.
담배 BY-2 세포(Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)는 S. Hasezawa(도쿄대학교)로부터 제공받았습니다. BY-2 세포를 변형된 Linsmeier and Skoog 배지에 95배 희석하고 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-DPA)을 매주 첨가했습니다.32 세포 현탁액을 27°C, 암실에서 130rpm으로 회전식 셰이커를 이용하여 혼합했습니다. 세포를 신선한 배지의 10배 부피로 세척하고 동일한 배지에 재현탁했습니다. 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 하에서 미세소관 마커 TagRFP-TUA6 또는 액틴 필라멘트 마커 GFP-ABD2를 안정적으로 발현하는 BY-2 형질전환 세포주는 이전에 기술된 방법33,34,35에 따라 제작했습니다. 이들 세포주는 기존 BY-2 세포주와 유사한 절차를 사용하여 유지 및 동기화할 수 있습니다.
HeLa 세포는 10% 태아 소 혈청, 1.2 U/ml 페니실린 및 1.2 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM)(Life Technologies)에서 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양되었습니다.
본 논문에 기술된 모든 실험은 일본의 생물안전 규정 및 지침에 따라 수행되었습니다.
화합물은 디메틸설폭사이드(DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical)에 용해하여 스톡 용액을 제조한 후, 애기장대와 담배의 경우 MS 배지에, 우산이끼의 경우 Gamborg B5 배지에 희석하였다. 뿌리 생장 억제 실험의 경우, 각 플레이트당 10개 이상의 종자를 해당 화합물 또는 DMSO가 함유된 한천 배지에 파종하였다. 종자는 생장 챔버에서 7일 동안 배양하였다. 묘목의 사진을 촬영하고 뿌리의 길이를 측정하였다. 애기장대 발아 실험의 경우, 각 플레이트당 48개의 종자를 200 μM 농도의 화합물 또는 DMSO가 함유된 한천 배지에 파종하였다. 애기장대 종자는 생장 챔버에서 재배하였고, 발아 7일 후 발아한 묘목의 수를 세었다. 담배 발아 실험의 경우, 각 플레이트당 24개의 종자를 200 μM 농도의 KAND 또는 DMSO가 함유된 한천 배지에 파종하였다. 담배 종자는 생장 챔버에서 재배하였고, 14일 후 발아한 묘목의 수를 세었다. 우산이끼 생장 억제 실험을 위해 각 플레이트에서 9개의 배아를 KAND 또는 DMSO의 표시된 농도가 포함된 한천 배지에 접종하고 생장 챔버에서 14일 동안 배양했습니다.
뿌리 분열조직의 구조를 시각화하기 위해 5mg/ml 프로피디움 아이오다이드(PI)로 염색한 묘목을 사용했습니다. PI 신호는 TCS SPE 공초점 레이저 스캐닝 현미경(라이카 마이크로시스템즈)을 이용한 형광 현미경으로 관찰했습니다.
뿌리의 조직화학적 염색은 β-글루쿠로니다제(GUS)를 이용하여 Malami와 Benfey가 기술한 프로토콜36에 따라 수행하였다. 묘목을 90% 아세톤에 하룻밤 고정시킨 후, GUS 완충액에 0.5 mg/ml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-d-글루쿠론산을 첨가하여 1시간 동안 염색하고, 수화된 클로랄알데히드 용액(클로랄수화물 8g, 물 2ml, 글리세롤 1ml)에 담근 후, Axio Imager M1 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 미분간섭현미경으로 관찰하였다.
수직으로 세운 접시에서 재배한 7일 된 묘목의 뿌리 각도를 측정했습니다. 6단계에서 설명한 대로 중력 벡터 방향을 기준으로 뿌리의 각도를 측정합니다.
피질 미세소관의 배열은 프로토콜 37에 약간의 수정을 가하여 기술된 대로 관찰하였다. 항-β-튜불린 항체(KMX-1, Merk Millipore: MAB3408)와 Alexa Fluor 488 접합 항마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A32723)를 각각 1:1000 및 1:100 희석액으로 1차 및 2차 항체로 사용하였다. 형광 이미지는 TCS SPE 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 획득하였다. 제조사의 지침에 따라 Z-스택 이미지를 획득하고 최대 강도 투영 이미지를 생성하였다.
HeLa 세포 증식 분석은 제조사의 지침에 따라 Cell Counting Kit 8(Dojindo)을 사용하여 수행하였다.
대장균 DH5α의 성장은 분광광도계를 이용하여 600nm에서 세포 밀도(OD600)를 측정함으로써 분석하였다.
형질전환 BY-2 세포의 세포골격 구조는 CSU-X1 공초점 스캐닝 장치(Yokogawa)와 sCMOS 카메라(Zyla, Andor Technology)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 세포골격 밀도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 공초점 이미지에서 세포질 픽셀 중 세포골격 픽셀의 비율을 정량화하는 이미지 분석을 통해 평가하였다(참고문헌38,39).
BY-2 세포의 세포 사멸을 검출하기 위해 세포 현탁액의 일부를 0.05% 에반스 블루 용액과 함께 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 사멸 세포의 선택적 에반스 블루 염색은 손상되지 않은 세포막을 통해 생존 세포에서 염료가 배출되는 것에 달려 있습니다.40 염색된 세포는 명시야 현미경(BX53, Olympus)을 사용하여 관찰했습니다.
HeLa 세포는 37°C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포에 100 μM KAND 11, 쿠마모나믹산 6, 쿠마모나미드 1, 100 ng/ml 콜세미드(Gibco) 또는 100 ng/ml 노코드메이즈(Sigma)를 37°C에서 6시간 동안 처리하였다. 세포를 실온에서 메탄올로 10분간, 이어서 아세트산으로 5분간 고정하였다. 고정된 세포를 0.5% BSA/PBS에 희석한 β-튜불린 1차 항체(1D4A4, Proteintech: 66240-1)와 함께 2시간 동안 배양하고, TBST로 3회 세척한 후, Alexa Fluor 염소 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific: A11001)와 15 ng/ml의 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 0.5% BSA/PBS에 희석하여 사용했습니다. TBST로 세 번 세척한 후, 염색된 세포를 Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경으로 관찰했습니다. 이미지는 냉각식 Hamamatsu ORCA-R2 CCD 카메라와 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 촬영했습니다.
게시 시간: 2024년 6월 17일