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식물 유래 살충 화합물의 조합은 해충에 대해 상승적 또는 길항적 상호작용을 나타낼 수 있습니다. 이집트숲모기(Aedes aegypti)가 매개하는 질병의 빠른 확산과 기존 살충제에 대한 이집트숲모기 개체군의 저항성 증가를 고려하여, 식물 정유를 기반으로 한 테르펜 화합물 28가지 조합을 제조하고 이집트숲모기의 유충 및 성충에 대한 효과를 시험했습니다. 먼저 5가지 식물 정유(EO)의 유충 및 성충 살충 효과를 평가했으며, GC-MS 분석을 통해 각 정유에서 주요 화합물 2가지를 확인했습니다. 확인된 주요 화합물인 디알릴 디설파이드, 디알릴 트리설파이드, 카르본, 리모넨, 유제놀, 메틸 유제놀, 유칼립톨, 유데스몰 및 모기 알파-피넨을 구입했습니다. 이들 화합물의 이중 조합을 아치사량으로 제조하고, 상승작용과 길항작용을 시험하여 확인하였다. 유충 살충 효과가 가장 우수한 조성물은 리모넨과 디알릴 디설파이드를 혼합한 것이고, 성충 살충 효과가 가장 우수한 조성물은 카르본과 리모넨을 혼합한 것이었다. 시판되는 합성 유충 살충제인 테메포스와 성충 살충제인 말라티온을 각각 단독으로 그리고 테르페노이드와의 이중 조합으로 시험하였다. 그 결과, 테메포스와 디알릴 디설파이드, 그리고 말라티온과 에우데스몰의 조합이 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 강력한 조합들은 이집트숲모기 방제에 활용될 가능성이 있다.
식물 정유(EO)는 다양한 생리활성 화합물을 함유하는 이차 대사산물로, 합성 살충제의 대안으로 점점 더 중요해지고 있습니다. 환경친화적이고 사용이 간편할 뿐만 아니라, 다양한 생리활성 화합물의 혼합물이기 때문에 내성 발현 가능성도 낮습니다.1 연구자들은 GC-MS 기술을 이용하여 다양한 식물 정유의 성분을 분석하고 17,500종의 방향성 식물에서 3,000개 이상의 화합물을 확인했으며2, 이들 대부분은 살충 효과를 시험한 결과 살충 효과가 있는 것으로 보고되었습니다.3,4 일부 연구에서는 해당 화합물의 주성분 독성이 조제 에틸렌옥사이드와 같거나 그 이상이라는 점을 강조합니다. 그러나 화학 살충제와 마찬가지로 개별 화합물을 사용하는 경우 내성 발현의 가능성이 여전히 남아 있습니다.5,6 따라서 현재 연구는 살충 효과를 향상시키고 대상 해충 개체군의 내성 발현 가능성을 줄이기 위해 에틸렌옥사이드 기반 화합물 혼합물을 제조하는 데 집중하고 있습니다. 에센셜 오일에 함유된 개별 활성 화합물은 조합 시 상승작용 또는 길항작용을 나타낼 수 있으며, 이는 에센셜 오일의 전반적인 활성을 반영합니다. 이러한 사실은 이전 연구자들의 연구에서도 잘 강조되어 왔습니다.7,8 매개체 방제 프로그램에도 에센셜 오일과 그 성분이 포함됩니다. 에센셜 오일의 모기 살충 활성은 큐렉스(Culex)와 아노펠레스(Anopheles) 모기를 대상으로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 여러 연구에서 다양한 식물을 시판되는 합성 살충제와 조합하여 독성을 높이고 부작용을 최소화하는 효과적인 살충제를 개발하려는 시도가 있었습니다.9 그러나 이집트숲모기(Aedes aegypti)에 대한 이러한 화합물 연구는 아직 드뭅니다. 의학의 발전과 약물 및 백신 개발은 일부 매개체 전염병 퇴치에 도움이 되었습니다. 그러나 이집트숲모기가 매개하는 바이러스의 다양한 혈청형으로 인해 백신 접종 프로그램이 실패하는 경우가 있습니다. 따라서 이러한 질병이 발생할 경우 매개체 방제 프로그램만이 질병 확산을 막을 수 있는 유일한 방법입니다. 현재 상황에서 이집트숲모기(Aedes aegypti) 방제는 매우 중요합니다. 이 모기는 뎅기열, 지카 바이러스, 뎅기출혈열, 황열병 등 다양한 질병을 유발하는 바이러스와 그 혈청형의 주요 매개체이기 때문입니다. 특히 이집트를 비롯한 전 세계에서 이집트숲모기를 매개로 하는 질병 발생 건수가 매년 증가하고 있다는 점이 주목할 만합니다. 따라서 이집트숲모기 개체군을 효과적으로 방제할 수 있는 환경 친화적인 방법을 개발하는 것이 시급합니다. 이러한 맥락에서 에센셜 오일(EO), 그 구성 성분, 그리고 이들의 조합이 유력한 방제 수단으로 고려될 수 있습니다. 본 연구는 살충 효과가 있는 다섯 가지 식물(민트, 바질, 유칼립투스, 마늘, 멜라루카)에서 추출한 주요 에센셜 오일 화합물의 시너지 효과를 내는 조합을 찾아 이집트숲모기에 대한 효과를 검증하고자 했습니다.
선별된 모든 에센셜 오일은 24시간 LC50 값이 0.42~163.65ppm 범위로 이집트숲모기 유충에 대한 잠재적인 살충 활성을 나타냈다. 가장 높은 살충 활성은 페퍼민트(Mp) 에센셜 오일에서 24시간 LC50 값 0.42ppm으로 나타났으며, 그 다음으로 마늘(As) 에센셜 오일이 24시간 LC50 값 16.19ppm으로 나타났다(표 1).
오시뭄 생툼(Ocimum Sainttum) 에센셜 오일을 제외한 나머지 네 가지 에센셜 오일은 모두 뚜렷한 알레르기 유발 물질 사멸 효과를 보였으며, 24시간 노출 기간 동안 LC50 값은 23.37~120.16ppm 범위였습니다. 티모필루스 스트리아타(Thymophilus striata, Cl) 에센셜 오일은 24시간 노출 이내에 LC50 값이 23.37ppm으로 성충 사멸에 가장 효과적이었으며, 유칼립투스 마쿨라타(Eucalyptus maculata, Em) 에센셜 오일은 LC50 값이 101.91ppm으로 그 뒤를 이었습니다(표 1). 한편, 오시뭄 생툼(Ocimum Sainttum)의 경우 최고 농도에서 53%의 사망률이 기록되어 LC50 값은 아직 확정되지 않았습니다(보충 그림 3).
각 에센셜 오일(EO)의 주요 구성 성분 두 가지는 NIST 라이브러리 데이터베이스 결과, GC 크로마토그램 면적 백분율 및 MS 스펙트럼 결과를 기반으로 확인 및 선택되었습니다(표 2). As EO의 경우, 주요 화합물은 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드였고, Mp EO의 경우, 주요 화합물은 카르본과 리모넨이었으며, Em EO의 경우, 주요 화합물은 유데스몰과 유칼립톨이었습니다. Os EO의 경우, 주요 화합물은 유제놀과 메틸 유제놀이었고, Cl EO의 경우, 주요 화합물은 유제놀과 α-피넨이었습니다(그림 1, 보충 그림 5~8, 보충 표 1~5).
선별된 에센셜 오일의 주요 테르페노이드에 대한 질량 분석 결과 (A-디알릴 디설파이드; B-디알릴 트리설파이드; C-유제놀; D-메틸 유제놀; E-리모넨; F-방향족 세페론; G-α-피넨; H-시네올; R-유다몰).
총 9가지 화합물(디알릴 디설파이드, 디알릴 트리설파이드, 유제놀, 메틸 유제놀, 카르본, 리모넨, 유칼립톨, 유데스몰, α-피넨)이 에센셜 오일의 주요 성분으로 확인되었으며, 이들 화합물은 각각 이집트숲모기 유충에 대한 생물검정을 통해 효능을 평가하였다. 유데스몰은 24시간 노출 후 LC50 값이 2.25ppm으로 가장 높은 유충 살충 활성을 나타냈다. 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드 또한 10~20ppm 범위의 평균 아치사량에서 잠재적인 유충 살충 효과를 보였다. 유제놀, 리모넨, 유칼립톨은 각각 LC50 값이 63.35ppm, 139.29ppm으로 중간 정도의 유충 살충 활성을 나타냈다. 24시간 후 각각 181.33ppm의 농도를 나타냈다(표 3). 그러나 메틸 유제놀과 카르본은 최고 농도에서도 유의미한 유충 살충 효과가 나타나지 않아 LC50 값은 계산하지 않았다(표 3). 합성 살충제 테메포스는 24시간 노출 후 이집트숲모기에 대해 평균 치사 농도가 0.43ppm이었다(표 3, 부록 표 6).
디알릴 디설파이드, 디알릴 트리설파이드, 유칼립톨, α-피넨, 에우데스몰, 리모넨, 카르본 등 7가지 화합물이 유효 에센셜 오일의 주요 성분으로 확인되었으며, 이들은 각각 이집트산 이집트숲모기 성충에 대한 효과를 시험하였다. 프로빗 회귀 분석 결과, 에우데스몰이 LC50 값 1.82 ppm으로 가장 높은 효능을 보였고, 유칼립톨이 LC50 값 17.60 ppm으로 그 뒤를 이었다. 나머지 5가지 화합물은 LC50 값이 140.79~737.01 ppm 범위로 성충에 대해 중간 정도의 유해성을 나타냈다(표 3). 합성 유기인계 화합물인 말라티온은 에우데스몰보다 효능이 약했지만, 다른 6가지 화합물보다는 높은 효능을 보였으며, 24시간 노출 시 LC50 값은 5.44 ppm이었다(표 3, 부록 표 6).
7가지 강력한 선도 화합물과 유기인계 살충제인 타메포세이트를 선택하여 LC50 농도를 1:1 비율로 조합한 이진 화합물을 제조하였다. 총 28가지 이진 화합물을 제조하여 이집트숲모기 유충에 대한 살충 효과를 시험하였다. 그 결과, 9가지 화합물은 상승작용을, 14가지 화합물은 길항작용을 나타냈으며, 5가지 화합물은 살충 효과가 없었다. 상승작용을 나타낸 화합물 중에서는 디알릴 디설파이드와 테모폴의 조합이 24시간 후 100%의 살충 효과를 보여 가장 효과적이었다(표 4). 마찬가지로, 리모넨과 디알릴 디설파이드, 그리고 유제놀과 티메트포스의 혼합물도 98.3%의 살충 효과를 보여 우수한 잠재력을 나타냈다(표 5). 나머지 4가지 조합, 즉 유데스몰과 유칼립톨, 유데스몰과 리모넨, 유칼립톨과 알파-피넨, 알파-피넨과 테메포스 또한 90% 이상의 사망률을 보이는 유의미한 유충 살충 효과를 나타냈다. 예상 사망률은 60~75% 정도이다(표 4). 그러나 리모넨과 알파-피넨 또는 유칼립투스의 조합은 길항 작용을 보였다. 마찬가지로 테메포스와 유제놀, 유칼립투스, 유데스몰 또는 디알릴 트리설파이드의 혼합물도 길항 작용을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드의 조합, 그리고 이들 화합물 중 하나와 유데스몰 또는 유제놀의 조합은 유충 살충 작용에 있어 길항 작용을 보였다. 유데스몰과 유제놀 또는 α-피넨을 병용했을 때 길항작용이 나타난다는 보고도 있습니다.
성충의 산성 활성을 평가하기 위해 테스트한 28가지 이성분 혼합물 중 7가지 조합은 상승작용을 보였고, 6가지 조합은 효과가 없었으며, 15가지 조합은 길항작용을 보였다. 유데스몰과 유칼립투스, 그리고 리모넨과 카르본의 혼합물은 다른 상승작용 조합보다 효과적이었으며, 24시간 후 사망률은 각각 76%와 100%였다(표 5). 말라티온은 리모넨과 디알릴 트리설파이드를 제외한 모든 화합물 조합에서 상승작용을 나타내는 것으로 관찰되었다. 반면, 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드는 유칼립투스, 유칼립톨, 카르본 또는 리모넨과 조합했을 때 길항작용을 보였다. 마찬가지로, α-피넨과 에우데스몰 또는 리모넨의 조합, 유칼립톨과 카르본 또는 리모넨의 조합, 그리고 리모넨과 에우데스몰 또는 말라티온의 조합은 길항적인 유충 살충 효과를 나타냈다. 나머지 6가지 조합에서는 예상 사망률과 관찰된 사망률 사이에 유의미한 차이가 없었다(표 5).
상승 효과와 아치사량에 근거하여, 다수의 이집트숲모기에 대한 유충 살충 효과를 최종적으로 선별하고 추가 시험을 진행하였다. 그 결과, 유제놀-리모넨, 디알릴디설파이드-리모넨, 디알릴디설파이드-티메포스의 이원 조합에서 관찰된 유충 사망률은 100%였으며, 예상 사망률은 각각 76.48%, 72.16%, 63.4%였다(표 6). 리모넨과 유데스몰의 조합은 상대적으로 효과가 떨어져 24시간 노출 기간 동안 88%의 유충 사망률이 관찰되었다(표 6). 요약하면, 선별된 네 가지 이원 조합은 대규모로 적용했을 때 이집트숲모기에 대해 상승적인 유충 살충 효과를 나타냈다(표 6).
대규모 이집트숲모기 성충 개체군을 제어하기 위한 성충 살충 생물검정에 세 가지 상승작용 조합을 선정했습니다. 대규모 곤충 군집에 적용할 조합을 선택하기 위해, 먼저 카르본과 리모넨, 그리고 유칼립톨과 에우데스몰, 이 두 가지 테르펜 조합에서 가장 우수한 상승작용을 보이는 조합에 집중했습니다. 둘째로, 합성 유기인계 살충제인 말라티온과 테르페노이드의 조합 중에서 가장 우수한 상승작용 조합을 선정했습니다. 말라티온과 에우데스몰 조합은 가장 높은 살충 효과를 보였고, 후보 성분들의 LC50 값이 매우 낮아 대규모 곤충 군집에 적용하기에 가장 적합한 조합이라고 판단했습니다. 말라티온은 α-피넨, 디알릴 디설파이드, 유칼립투스, 카르본, 에우데스몰과 조합 시 상승작용을 나타냅니다. 특히 LC50 값을 살펴보면, 에우데스몰이 2.25ppm으로 가장 낮은 값을 보였습니다. 말라티온, α-피넨, 디알릴 디설파이드, 유칼립톨 및 카르본의 계산된 LC50 값은 각각 5.4, 716.55, 166.02, 17.6 및 140.79 ppm이었습니다. 이 값들은 말라티온과 유데스몰의 조합이 투여량 측면에서 최적의 조합임을 나타냅니다. 카르본과 리모넨의 조합, 그리고 유데스몰과 말라티온의 조합은 예상 사망률 61~65%에 비해 100%의 관찰 사망률을 보였습니다. 또 다른 조합인 유데스몰과 유칼립톨의 조합은 24시간 노출 후 예상 사망률 60%에 비해 78.66%의 사망률을 나타냈습니다. 선택된 세 가지 조합 모두 성충 이집트숲모기에 대해 대규모로 적용했을 때에도 상승 효과를 보였습니다(표 6).
본 연구에서 Mp, As, Os, Em, Cl과 같은 특정 식물 에센셜 오일은 이집트숲모기(Aedes aegypti)의 유충 및 성충에 대해 유망한 살충 효과를 나타냈다. Mp 에센셜 오일은 0.42ppm의 LC50 값으로 가장 높은 유충 살충 활성을 보였으며, As, Os, Em 에센셜 오일은 24시간 후 50ppm 미만의 LC50 값을 나타냈다. 이러한 결과는 모기 및 기타 파리목 곤충에 대한 이전 연구 결과와 일치한다.10,11,12,13,14 Cl의 유충 살충 효능은 24시간 후 163.65ppm의 LC50 값으로 다른 에센셜 오일보다 낮지만, 성충에 대한 효능은 24시간 후 23.37ppm의 LC50 값으로 가장 높았다. Mp, As 및 Em EO는 24시간 노출 시 100~120ppm 범위의 LC50 값을 나타내며 우수한 알레르기 유발 가능성을 보였지만, 유충 살충 효과에 비해서는 상대적으로 낮았습니다. 반면, Os EO는 최고 치료 용량에서도 무시할 만한 수준의 알레르기 유발 효과를 나타냈습니다. 따라서 이러한 결과는 에틸렌옥사이드의 식물 독성이 모기의 발달 단계에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다.15 또한 EO가 곤충 체내로 침투하는 속도, 특정 표적 효소와의 상호작용, 그리고 각 발달 단계에서 모기의 해독 능력에 따라 달라집니다.16 많은 연구에서 에틸렌옥사이드의 생물학적 활성에 있어 주성분 화합물이 중요한 요소라는 사실이 밝혀졌는데, 이는 주성분 화합물이 전체 화합물의 대부분을 차지하기 때문입니다.3,12,17,18 따라서 본 연구에서는 각 EO에서 두 가지 주요 화합물을 고려했습니다. GC-MS 분석 결과, 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드가 As 에센셜 오일의 주요 성분으로 확인되었으며, 이는 기존 연구 결과와 일치합니다.19,20,21 멘톨이 주요 성분 중 하나라는 기존 보고도 있었지만, Mp 에센셜 오일에서는 카르본과 리모넨이 주요 성분으로 다시 확인되었습니다.22,23 Os 에센셜 오일의 성분 분석 결과, 유제놀과 메틸 유제놀이 주요 성분으로 나타났으며, 이는 이전 연구자들의 결과와 유사합니다.16,24 유칼립톨은 Em 잎 오일의 주요 성분으로 보고되었으며, 이는 일부 연구자들의 결과와 일치하지만, Olalade 등의 연구 결과와는 상반됩니다.25,26 멜라루카 에센셜 오일에서는 시네올과 α-피넨이 주요 성분으로 나타났으며, 이는 기존 연구 결과와 유사합니다.28,29 서로 다른 지역에서 동일한 식물 종에서 추출한 에센셜 오일의 조성 및 농도에 종내 차이가 있다는 보고가 있으며, 본 연구에서도 이러한 차이가 관찰되었습니다. 이는 지리적 식물 생장 조건, 수확 시기, 발달 단계, 식물 연령, 화학형 출현 등의 영향을 받습니다.22,30,31,32 확인된 주요 화합물들을 구입하여 이집트숲모기(Aedes aegypti) 유충에 대한 살충 효과와 성충에 대한 효과를 시험했습니다. 그 결과, 디알릴 디설파이드의 유충 살충 활성은 조제 에센셜 오일(As)과 유사한 것으로 나타났습니다. 그러나 디알릴 트리설파이드의 활성은 조제 에센셜 오일보다 높았습니다. 이러한 결과는 필리핀잠자리(Culex philippines)에 대한 Kimbaris 등33의 연구 결과와 유사합니다. 하지만 이 두 화합물은 대상 모기에 대한 자가살충 활성은 좋지 않았으며, 이는 집게벌레(Tenebrio molitor)에 대한 Plata-Rueda 등34의 연구 결과와 일치합니다. Os EO는 이집트숲모기 유충에는 효과적이지만 성충에는 효과가 없습니다. 주요 개별 화합물의 유충 살충 활성은 조제 Os EO보다 낮다는 것이 밝혀졌습니다. 이는 조제 에틸렌옥사이드에 다른 화합물과 그 상호작용이 관여함을 시사합니다. 메틸유제놀 단독으로는 활성이 미미한 반면, 유제놀 단독으로는 중간 정도의 유충 살충 활성을 나타냅니다. 이러한 결론은 한편으로는 이전 연구자들의 결론(35,36)을 뒷받침하지만, 다른 한편으로는 그 결론(37,38)과 상반됩니다. 유제놀과 메틸유제놀의 작용기 차이로 인해 동일한 대상 곤충에 대한 독성이 다를 수 있습니다(39). 리모넨은 중간 정도의 유충 살충 활성을 나타낸 반면, 카르본의 효과는 미미했습니다. 마찬가지로, 리모넨의 성충에 대한 상대적으로 낮은 독성과 카르본의 높은 독성은 일부 이전 연구 결과(40)를 뒷받침하지만 다른 연구 결과(41)와는 상반됩니다. 고리 내 및 고리 외 위치 모두에 이중 결합이 존재하면 이러한 화합물의 유충 살충 효과가 향상될 수 있습니다.3,41 반면, 알파 및 베타 탄소에 불포화 결합이 있는 케톤인 카르본은 성충에 대한 독성 가능성이 더 높을 수 있습니다.42 그러나 리모넨과 카르본의 개별적인 특성은 전체 에센셜 오일의 Mp(표 1, 표 3)보다 훨씬 낮습니다. 시험된 테르페노이드 중 유데스몰은 LC50 값이 2.5ppm 미만으로 가장 강력한 유충 및 성충 살충 활성을 나타내어 이집트숲모기 방제에 유망한 화합물입니다. 유데스몰의 성능은 전체 에센셜 오일 Em보다 우수하지만, 이는 Cheng et al.40의 연구 결과와는 일치하지 않습니다. 유데스몰은 두 개의 이소프렌 단위를 가진 세스퀴테르펜으로, 유칼립투스와 같은 산소 함유 모노테르펜보다 휘발성이 낮아 살충제로서의 잠재력이 더 큽니다. 유칼립톨 자체는 유충 살충 효과보다 성충 살충 효과가 더 크며, 이전 연구 결과들은 이를 뒷받침하는 의견과 반박하는 의견을 모두 제시하고 있습니다.37,43,44 유칼립톨의 활성은 전체 에센셜 오일(EO Cl)의 활성과 거의 유사합니다. 또 다른 이환식 모노테르펜인 α-피넨은 이집트숲모기(Aedes aegypti)에 대해 유충 살충 효과보다 성충 살충 효과가 적으며, 이는 전체 EO Cl의 효과와는 정반대입니다. 테르페노이드의 전반적인 살충 활성은 친유성, 휘발성, 탄소 분지, 투영 면적, 표면적, 작용기 및 그 위치에 영향을 받습니다.45,46 이러한 화합물들은 세포 축적물 파괴, 호흡 활동 차단, 신경 전달 방해 등의 기전을 통해 작용할 수 있습니다.47 합성 유기인산염인 테메포스는 0.43ppm의 LC50 값으로 가장 높은 유충 살충 활성을 나타냈으며, 이는 Lek-Utala의 데이터와 일치합니다.48 합성 유기인계 살충제인 말라티온의 성충 활성은 5.44ppm에서 보고되었습니다. 이 두 가지 유기인계 살충제는 실험실에서 사육된 이집트숲모기(Aedes aegypti)에 대해 양호한 반응을 보였지만, 세계 여러 지역에서 모기의 내성이 보고되었습니다.49 그러나 약초에 대한 내성 발생에 관한 유사한 보고는 발견되지 않았습니다.50 따라서 식물성 살충제는 해충 방제 프로그램에서 화학 살충제의 잠재적인 대안으로 고려되고 있습니다.
유충 살충 효과는 강력한 테르페노이드와 티메트포스를 함유한 테르페노이드로 제조한 28가지 이진 조합(1:1)에 대해 시험한 결과, 9가지 조합에서 상승작용, 14가지 조합에서 길항작용, 5가지 조합에서 길항작용이 나타났습니다. 반면, 성충 효능 생물검정에서는 7가지 조합에서 상승작용, 15가지 조합에서 길항작용이 나타났으며, 6가지 조합에서는 효과가 없는 것으로 보고되었습니다. 특정 조합에서 상승작용이 나타나는 이유는 후보 화합물들이 서로 다른 중요한 경로에서 동시에 상호작용하거나, 특정 생물학적 경로의 핵심 효소들을 순차적으로 억제하기 때문일 수 있습니다.51 리모넨과 디알릴 디설파이드, 유칼립투스 또는 유제놀의 조합은 소규모 및 대규모 적용 모두에서 상승 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌습니다(표 6). 반면, 유칼립투스 또는 α-피넨과의 조합은 유충에 대해 길항 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다. 평균적으로 리모넨은 메틸기의 존재, 각질층으로의 우수한 침투력, 그리고 서로 다른 작용 기전52,53으로 인해 우수한 상승 효과를 나타내는 것으로 보입니다. 리모넨은 곤충의 큐티클을 투과하여 접촉 독성을 나타내거나, 소화계에 영향을 미쳐 섭식 억제 효과를 나타내거나, 호흡기계에 영향을 미쳐 훈증 작용을 일으키는 것으로 보고된 바 있습니다.54 반면 유제놀과 같은 페닐프로파노이드는 대사 효소에 영향을 미칠 수 있습니다.55 따라서 작용 기전이 다른 화합물의 조합은 혼합물의 전반적인 살충 효과를 증가시킬 수 있습니다. 유칼립톨은 디알릴 디설파이드, 유칼립투스 또는 α-피넨과 상승작용을 나타내는 것으로 밝혀졌지만, 다른 화합물과의 조합은 유충 살충 효과가 없거나 길항작용을 보였다. 초기 연구에서는 유칼립톨이 아세틸콜린에스테라제(AChE)뿐만 아니라 옥타아민 및 GABA 수용체에 대한 억제 활성을 가지고 있음을 보여주었다.56 고리형 모노테르펜인 유칼립톨, 유제놀 등은 신경독성 활성과 동일한 작용 기전을 가질 수 있으므로,57 상호 억제를 통해 병용 효과를 최소화할 수 있다. 마찬가지로, 테메포스와 디알릴 디설파이드, α-피넨 및 리모넨의 조합은 상승작용을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 허브 제품과 합성 유기인산염 사이의 상승 효과에 대한 이전 보고를 뒷받침한다.58
에우데스몰과 유칼립톨의 조합은 이집트숲모기(Aedes aegypti)의 유충 및 성충 단계에 상승 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌는데, 이는 두 물질의 화학 구조가 다르기 때문에 작용 방식이 다를 수 있기 때문일 가능성이 있습니다. 세스퀴테르펜인 에우데스몰은 호흡기계에 영향을 미칠 수 있고, 모노테르펜인 유칼립톨은 아세틸콜린에스테라제에 영향을 미칠 수 있습니다. 두 가지 이상의 표적 부위에 성분을 동시에 노출시키면 조합의 전반적인 살충 효과가 향상될 수 있습니다. 성충 물질 생물검정에서 말라티온은 카르본, 유칼립톨, 디알릴 디설파이드 또는 α-피넨과 상승 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 리모넨과 디설파이드를 첨가했을 때 상승 효과가 나타남을 시사합니다. 알릴 트리설파이드를 제외한 모든 테르펜 화합물 포트폴리오에 대해 상승 효과를 나타내는 우수한 알레르기 유발 물질 후보 물질입니다. Thangam과 Kathiresan61 또한 말라티온과 허브 추출물의 상승 효과에 대한 유사한 결과를 보고했습니다. 이러한 상승 반응은 말라티온과 식물화학물질이 곤충의 해독 효소에 미치는 복합적인 독성 효과 때문일 수 있습니다. 말라티온과 같은 유기인산염은 일반적으로 시토크롬 P450 에스테라제와 모노옥시게나제를 억제함으로써 작용합니다62,63,64. 따라서 이러한 작용 기전을 가진 말라티온과 다른 작용 기전을 가진 테르펜을 병용하면 모기에 대한 전반적인 살충 효과가 향상될 수 있습니다.
반면에, 길항작용은 선택된 화합물들이 각각 단독으로 작용할 때보다 조합 시 활성이 감소함을 나타냅니다. 일부 조합에서 길항작용이 나타나는 이유는 한 화합물이 흡수, 분포, 대사 또는 배설 속도를 변화시켜 다른 화합물의 작용을 변형시키기 때문일 수 있습니다. 초기 연구자들은 이것이 약물 조합에서 길항작용의 원인이라고 생각했습니다. 마찬가지로, 길항작용의 가능한 원인은 유사한 작용 기전, 동일한 수용체 또는 표적 부위에 대한 구성 화합물의 경쟁과 관련될 수 있습니다. 어떤 경우에는 표적 단백질의 비경쟁적 저해가 발생할 수도 있습니다. 본 연구에서 두 가지 유기황 화합물인 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드는 동일한 표적 부위에 대한 경쟁으로 인해 길항작용을 나타냈습니다. 마찬가지로, 이 두 황 화합물은 길항작용을 보였으며, 유데스몰 및 α-피넨과 조합했을 때는 아무런 효과가 없었습니다. 유데스몰과 알파-피넨은 고리형 구조를 가지는 반면, 디알릴 디설파이드와 디알릴 트리설파이드는 지방족 구조를 가집니다. 화학 구조를 기반으로 할 때, 이들 화합물의 조합은 표적 부위가 일반적으로 다르기 때문에 전체적인 살충 활성을 증가시켜야 하지만34,47, 실험적으로는 길항 작용이 관찰되었습니다. 이는 생체 내에서 이들 화합물이 일부 알려지지 않은 유기체 시스템에서 상호작용하여 작용하는 방식 때문일 수 있습니다. 마찬가지로, 시네올과 알파-피넨의 조합에서도 길항 반응이 나타났는데, 이는 두 화합물의 작용 표적이 다르다는 기존 연구 결과47,60에도 불구하고 나타난 현상입니다. 두 화합물 모두 고리형 모노테르펜이기 때문에, 결합을 놓고 경쟁하는 공통 표적 부위가 존재하여 연구된 조합 쌍의 전체적인 독성에 영향을 미칠 수 있습니다.
LC50 값과 관찰된 사망률을 바탕으로, 가장 우수한 상승작용을 나타내는 테르펜 조합 두 가지, 즉 카르본 + 리모넨과 유칼립톨 + 에우데스몰 조합, 그리고 합성 유기인계 살충제인 말라티온과 테르펜을 조합하여 선정하였다. 최적의 상승작용 조합인 말라티온 + 에우데스몰 화합물을 성충 살충 생물검정에 적용하여 효과를 검증하였다. 대규모 곤충 군집을 대상으로 이러한 효과적인 조합이 비교적 넓은 공간에서 다수의 개체에 대해 효과를 발휘하는지 확인하였다. 모든 조합에서 대규모 곤충 떼에 대한 상승작용 효과가 나타났다. 최적의 상승작용 유충 살충 조합을 이집트숲모기 유충 대규모 개체군에 적용하여 유사한 결과를 얻었다. 따라서, 식물 에센셜 오일 화합물의 효과적인 상승작용 유충 및 성충 살충 조합은 기존의 합성 화학물질을 대체할 수 있는 강력한 후보이며, 이집트숲모기 개체군 방제에 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 마찬가지로, 합성 유충 살충제 또는 성충 살충제와 테르펜을 효과적으로 조합하면 모기에 투여하는 티메트포스 또는 말라티온의 용량을 줄일 수 있습니다. 이러한 강력한 시너지 효과를 내는 조합은 향후 이집트숲모기의 약물 내성 진화 연구에 대한 해결책을 제시할 수 있습니다.
이집트숲모기(Aedes aegypti) 알은 인도 의학연구위원회(Indian Council of Medical Research) 산하 디브루가르 지역 의학연구센터(Regional Medical Research Centre, Dibrugarh)에서 수집하여 가우하티 대학교 동물학과에서 온도(28 ± 1 °C)와 습도(85 ± 5%)를 조절하여 다음과 같은 조건에서 보관하였다. 부화 후 유충에게는 유충용 먹이(개 비스킷 가루와 효모를 3:1 비율로 혼합)를, 성충에게는 10% 포도당 용액을 공급하였다. 우화 3일째부터 암컷 성충 모기가 흰쥐의 피를 빨도록 하였다. 여과지를 물에 적신 유리컵을 산란장에 넣어 두었다.
본 연구에서는 유칼립투스 잎(도금양과), 바질(꿀풀과), 민트(꿀풀과), 멜라루카(도금양과), 그리고 알리움 구근(수선화과)을 식물 시료로 선정하였다. 시료는 구와하티에서 채집하였으며, 구와하티 대학교 식물학과에서 동정하였다. 채집한 식물 시료(500g)를 클레벤저 증류기를 이용하여 6시간 동안 수증기 증류하였다. 추출된 에센셜 오일은 깨끗한 유리병에 담아 4°C에서 보관하여 추가 연구에 사용하였다.
유충 살충 독성은 세계보건기구(WHO)의 표준 절차를 약간 수정하여 연구하였다(67). 유화제로 DMSO를 사용하였다. 각 에센셜 오일(EO) 농도는 초기에는 100ppm과 1000ppm으로 설정하고, 각 반복 실험에서 유충 20마리를 노출시켰다. 결과에 따라 농도 범위를 설정하고, 처리 후 1시간부터 6시간까지(1시간 간격), 그리고 24시간, 48시간, 72시간 후에 사망률을 기록했다. 아치사 농도(LC50)는 24시간, 48시간, 72시간 노출 후에 측정하였다. 각 농도는 음성 대조군(물만 사용)과 양성 대조군(DMSO 처리수 사용)과 함께 3회 반복 실험하였다. 번데기화가 발생하고 대조군 유충의 10% 이상이 사망한 경우, 실험을 반복하였다. 대조군의 사망률이 5~10%인 경우, Abbott 보정 공식(68)을 사용하였다.
Ramar et al. 69이 기술한 방법을 사용하여 아세톤을 용매로 하는 이집트숲모기 성충 생물검정을 수행했습니다. 각 에센셜 오일(EO)은 먼저 100ppm과 1000ppm 농도에서 이집트숲모기 성충에 대한 효과를 시험했습니다. 제조된 각 용액 2ml를 Whatman 번호가 매겨진 여과지(크기 12 x 15cm²) 1장에 도포하고 10분 동안 아세톤을 증발시켰습니다. 아세톤 2ml만 처리한 여과지는 대조군으로 사용했습니다. 아세톤이 증발한 후, 처리된 여과지와 대조군 여과지를 원통형 튜브(깊이 10cm)에 넣었습니다. 3~4일 된 흡혈하지 않은 모기 10마리를 각 농도별로 3개씩 넣어 실험했습니다. 예비 시험 결과를 바탕으로 선택된 오일의 다양한 농도를 시험했습니다. 모기 방출 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 사망률을 기록했습니다. 24시간, 48시간 및 72시간 노출 시간에 대한 LC50 값을 계산합니다. 대조군의 사망률이 20%를 초과하면 전체 시험을 반복합니다. 마찬가지로, 대조군의 사망률이 5%를 초과하면 Abbott의 공식68을 사용하여 처리군에 대한 결과를 조정합니다.
선택된 에센셜 오일의 구성 성분을 분석하기 위해 가스 크로마토그래피(Agilent 7890A)와 질량 분석기(Accu TOF GCv, Jeol)를 사용하였다. GC에는 FID 검출기와 모세관 컬럼(HP5-MS)이 장착되었으며, 운반 기체는 헬륨, 유속은 1 ml/min이었다. GC 프로그램은 Allium sativum을 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M으로, Ocimum Sainttum을 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5-280으로 설정하며, 민트는 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, 유칼립투스는 20.60-1M-10-200-3M-30-280, 그리고 붉은색의 경우 천 개의 층을 위해 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M으로 설정합니다.
각 에센셜 오일의 주요 화합물은 GC 크로마토그램과 질량 분석 결과에서 계산된 면적 백분율을 기반으로 식별되었습니다(NIST 70 표준 데이터베이스 참조).
각 에센셜 오일의 주요 화합물 두 가지는 GC-MS 분석 결과를 바탕으로 선별하여 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 순도 98~99%의 제품으로 구입하여 추가적인 생물학적 검정에 사용했습니다. 이 화합물들은 앞서 설명한 방법과 동일하게 이집트숲모기(Aedes aegypti)의 유충 및 성충에 대한 살충 효과를 시험했습니다. 가장 일반적으로 사용되는 합성 유충 살충제인 타메포세이트(시그마-알드리치)와 성충 살충제인 말라티온(시그마-알드리치)도 동일한 절차에 따라 분석하여 선별된 에센셜 오일 화합물과의 효과를 비교했습니다.
선별된 테르펜 화합물과 테르펜 화합물에 시판되는 유기인산염(틸레포스 및 말라티온)을 첨가한 이진 혼합물은 각 후보 화합물의 LC50 용량을 1:1 비율로 혼합하여 제조하였다. 제조된 혼합물은 앞서 설명한 바와 같이 이집트숲모기 유충 및 성충에 대해 시험하였다. 각 조합에 대해, 그리고 각 조합에 포함된 개별 화합물에 대해서도 각각 3회씩 생물검정을 실시하였다. 24시간 후 대상 곤충의 사망률을 기록하였다. 다음 공식을 이용하여 이진 혼합물의 예상 사망률을 계산하시오.
여기서 E는 이진 조합, 즉 연결(A + B)에 대한 이집트숲모기의 예상 사망률입니다.
각 이진 혼합물의 효과는 Pavla52가 설명한 방법에 따라 계산된 χ2 값을 기준으로 상승작용, 길항작용 또는 효과 없음으로 표시되었습니다. 다음 공식을 사용하여 각 조합에 대한 χ2 값을 계산하십시오.
어떤 조합의 효과가 상승적이라고 정의하는 기준은, 계산된 χ² 값이 해당 자유도에 대한 표 값(95% 신뢰구간)보다 크고 관찰된 사망률이 예상 사망률보다 높을 경우입니다. 마찬가지로, 어떤 조합에서든 계산된 χ² 값이 특정 자유도에서 표 값을 초과하지만 관찰된 사망률이 예상 사망률보다 낮으면 길항적이라고 간주합니다. 그리고 어떤 조합에서든 계산된 χ² 값이 해당 자유도에서 표 값보다 작으면 효과가 없다고 간주합니다.
잠재적으로 시너지 효과를 나타낼 수 있는 3~4가지 조합(유충 100마리, 유충 살충 활성 50%, 성충 살충 활성 50%)을 선택하여 다수의 곤충을 대상으로 시험했습니다. 성충 시험은 위와 동일한 방법으로 진행했습니다. 선택된 혼합물과 함께, 혼합물에 포함된 개별 화합물들도 동일한 수의 이집트숲모기 유충과 성충을 대상으로 시험했습니다. 조합 비율은 한 후보 화합물의 LC50 용량과 다른 구성 화합물의 LC50 용량의 1:1 비율입니다. 성충 활성 생물검정에서는 선택된 화합물을 아세톤에 용해시킨 후 1300cm³ 원통형 플라스틱 용기에 담긴 여과지에 도포했습니다. 아세톤을 10분 동안 증발시킨 후 성충을 투입했습니다. 마찬가지로, 유충 살충 생물검정에서는 LC50 용량의 후보 화합물을 먼저 동일 부피의 DMSO에 용해시킨 후 1300cc 플라스틱 용기에 담긴 1리터의 물과 혼합하고 유충을 투입했습니다.
기록된 71건의 사망 데이터에 대한 확률 분석을 SPSS(버전 16) 및 Minitab 소프트웨어를 사용하여 수행하여 LC50 값을 계산했습니다.
게시 시간: 2024년 7월 1일